[发明专利]一种林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法

权利要求书

1.一种林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法，其特征在于：以待测样品DNA为模板，以通用引物ITS1-F/ITS4-B、引物PtF和引物PtR为特异性引物，分别进行巢式PCR的第一、二轮反应，产物进行电泳检测，即可快速检测松树外生菌根中的彩色豆马勃；所述的引物PtF序列为：5'-GGGACCTGTGCGTTTCGT-3'；引物PtR序列为：5'-CATGCCCACCCGCTAATG-3'。

2.根据权利要求1所述的林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）采用CTAB法提取待测样品的DNA，在进行组培苗和实生苗菌根DNA提取时，当DNA溶于100ul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重复提取一次；

（2）巢式PCR反应，巢式PCR第一轮PCR反应的引物为通用引物ITS1-F/ITS4-B，反应体系20ul：10×PCR buffer（Mg²⁺ Free）2ul；MgCl₂（25mM）1.3ul；dNTP Mixture（各2.5mM）1.6ul；引物各1ul；rTaq酶（5U/ul）0.1ul；模板DNA 2ul；加无菌去离子水至20ul；PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性1min，57.8℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；巢式PCR第二轮反应以特异性引物PtF/PtR为引物，巢式PCR第一轮PCR产物稀释50倍，取2ul作为第二轮反应模板，PCR反应体系与第一轮相同，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；

（3）取巢式PCR产物进行琼脂凝胶电泳检测，电泳图中出现347bp条带即为检测出彩色豆马勃。

3.根据权利要求1所述的林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法，其特征在于：步骤（1）中，采用CTAB法提取待测样品的DNA时，在进行组培苗和实生苗菌根DNA提取时，当DNA溶于100ul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重复提取一次。