[发明专利]一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因植物的培育技术领域，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。

背景技术

水稻条纹叶枯病是由水稻条纹病毒引起的病毒性病害，由灰飞虱传播。近几年，水稻条纹叶枯病在我省及周边地区的水稻上连年猖獗，给江苏省的水稻生产和农民的经济利益造成了灾难性影响。该病最早于1897年在日本的关东发现，后在朝鲜、乌克兰、中国等地均有发生。目前它已分布于我国的16个省（市），给我国的水稻生产造成了严重损失。该病于上世纪60年代前后始见于江苏省，70年代在苏南、苏中少数地区曾一度流行，以后几乎是销声匿迹。但自80年代末期以来，水稻条纹叶枯病在我省的发生有所加重。进入21世纪，该病的发生度和发生范围逐年扩大，已成为长江淮河流域稻区水稻生产上最主要的病害，缺乏抗病品种也是水稻条纹叶枯病暴发的主要原因之一。

对待灰飞虱及其传播的条纹叶枯病，一般贯彻“预防为主，综合治理”的植保方针，采用治虫防病结合生态调控等一系列措施，国内外抗病育种的经验表明，选育抗病品种是控制水稻病害最经济有效的方法。选育抗病品种首先要筛选或创制抗源，以往鉴定出的高抗品种多具籼稻血缘，与现有品种杂交后后代品系很难育成优质米品种。到目前为止，粳稻中还未找到1个对条纹叶枯病高度免疫的基因。也就是说，由于品种的限制，现有的抗源材料较难作为优良亲本组配杂交组合用于后代选育。

RNA干扰（RNAi，RNA interference）是指在进化过程中高度保守的、有双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制。由dsRNA介导的干扰现象作为细胞的一种防御机制可针对性地降解细胞内与之具有同源性的核酸(如病毒的核酸)，达到对病毒的抵抗，同时还调节细胞内编码基因的表达，为利用RNA介导的病毒抗性进行抗病毒基因工程的研究奠定了基础。目前，RNAi已经广泛用于基因的功能分析、疾病治疗和抗病虫抗源创制。

目前还未见利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的报道。

发明内容

本发明的主要目的就是针对上述水稻条纹叶枯病的研究现状，提供一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法：

以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列作为抗水稻条纹叶枯病的目的基因序列，分别以下述两对引物F1/R1和F2/R2进行PCR扩增，扩增得到CP和SP基因片段序列，设计上下游引物5’端引入限制性内切酶位点Bgl II和Xho I，酶切位点外侧添加2个保护碱基以保证酶切完全，两对引物分别如下：

F1: CGCTCGAGGTTCAGTCTAGTCATCTGCAC; （SEQ ID NO.3）

R1: CGAGATCTTAGAATGGGTACCAACAAGCC; （SEQ ID NO.4）

F2: CGCTCGAGAGAATCGAAGATGCAAGAGGTA; （SEQ ID NO.5）

R2: CGAGATCTGCTATGTTTTGTGTAGAAGAGG; （SEQ ID NO.6）

将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pUCCRNAi，于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入pUCCRNAi载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2；

用限制性内切酶分别酶切中间载体pUCCRNAi-CP和pUCCRNAi-SP，以及植物表达载体pCam23A，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pCam23A载体中，即为构建成功的植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP；

将植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP，利用农杆菌介导法分别转入优良水稻品种的胚性愈伤组织，通过G-418筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。

本发明所说的方法，具体步骤如下：

(1)水稻条纹叶枯病毒CP和SP基因RNAi载体的构建