[发明专利]一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法

权利要求书

1.一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法，其特征在于：

   分别以下述两对引物F1/R1和F2/R2进行PCR扩增，从水稻基因中扩增得到CP和SP基因片段序列，CP和SP基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：

F1: CGCTCGAGGTTCAGTCTAGTCATCTGCAC;

R1: CGAGATCTTAGAATGGGTACCAACAAGCC; 

F2: CGCTCGAGAGAATCGAAGATGCAAGAGGTA;

R2: CGAGATCTGCTATGTTTTGTGTAGAAGAGG;

将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pUCCRNAi，于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入pUCCRNAi载体中，形成含反向重复目的片段的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2；

用限制性内切酶分别酶切中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2，以及植物表达载体pCam23A，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pCam23A载体中，即为构建成功的植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP；

将植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP，利用农杆菌介导法分别转入水稻的胚性愈伤组织，通过G-418筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。

2.根据权利要求1所述的利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法，其特征在于其步骤如下：

(1)水稻条纹叶枯病毒CP和SP基因RNAi载体的构建

1) 分别以下述F1/R1和F2/R2为引物，水稻条纹叶枯病病毒总RNA为模板，进行PCR扩增获得序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的述的CP和SP基因序列，再将CP和SP基因序列分别克隆到pMD18-T，得pMD-CP和pMD-SP；

2) 构建含反向重复序列的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2

① 构建含正向序列的中间载体pUCCRNAi-CP1和pUCCRNAi-SP1

将pMD-CP、pMD-SP和pUCCRNAi经Bgl II和Xho I酶切获得的片段进行连接，分别得到pUCCRNAi-CP1和pUCCRNAi-SP1；

② 构建含反向重复序列的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2

将①中得到的含正向序列的中间载体pUCCRNAi-CP1和pUCCRNAi-SP1用限制性内切酶酶BamH I和Sal I进行酶切，回收酶切的目的条带，将其与BglII和Xho I酶切pMD-CP和pMD-SP获得的CP和SP基因序列进行连接，得到含反向重复目的片段的中间载体，命名为pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2；

③ 构建含反向重复序列的表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP

Pst I单酶切含反向重复目的片段的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2，PstI单酶切植物表达载体pCam23A，分别回收反向重复序列和植物表达载体片段， T4 DNA连接酶连接，得到的阳性克隆分别为pCam23A-CP和pCam23A-SP；

(2)将植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP，利用农杆菌介导法分别转入水稻胚性愈伤组织，通过G-418筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。