[发明专利]转录因子ORCA3和关键酶G10H双基因共转化提高喜树碱含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域，特别是一种转录因子ORCA3和关键酶G10H双基因共转化代谢工程策略提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法。

背景技术

喜树碱(Camptothecin，CPT)是最早从中国特有的喜树(Camptotheca acuminata)中提取出来的一种具有显著抗肿瘤活性的生物碱。现有多种喜树碱类药物如依立替康(Irinotecan)和拓扑替康(Topotecan)获得美国FDA(1992)认证，在临床上被广泛用于治疗卵巢癌、直肠癌及白血病等多种恶性肿瘤，全球市场需求十分巨大。目前世界上喜树碱类药物的生产主要是从喜树等植株中提取，然而由于喜树天然资源数量有限，生长十分缓慢，喜树碱及其类似物在植物体内含量又非常低，且提取环节多、费时费力，所以从天然喜树中提取喜树碱的方法已远远不能满足人们对喜树碱日益增长的需求。

多年来，国内外学者围绕着扩大喜树碱药源问题进行了诸多领域的研究如化学全合成，半合成及细胞培养等，并取得了一定的进展。喜树碱的化学全合成虽然已经成功，但因成本太高、产量太低、周期 太长且易造成环境污染等因素而限制了其商业化生产；半合成方法虽然是目前最有效的途径之一，但其前体的提取分离仍然依赖于天然资源的供应；细胞悬浮培养则存在喜树碱含量低微及稳定性较差等问题同样难以实现工业化生产(Hengel et al 1992)。相比之下，利用基因工程技术将喜树碱生物合成途径中的关键酶基因导入产喜树碱的资源植物中，继而获得转基因的发根系或再生植株等，并进行大规模的培养是实现从根本上提高喜树碱含量的最佳途径之一(Lorence and Nessler2004，Lu et al 2008)。

大量研究表明，异胡豆苷合成酶(STR)，色氨酸脱羧酶(Tryptophan decarboxylase，TDC)，香叶醇-10-脱氢酶即牻牛儿醇-10-羟化酶(Geraniol 10-hydroxylase，G10H)及1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(1-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Synthase，DXS)等关键酶在包括喜树碱在内的TIAs的生物合成中具有重要作用(Canel et al 1998；De Luca et al 1989； -Meyer 1997；Yamazaki et al 2003；McKnight et al 1990；Kutchan 1989；Yamazaki et al 2003；Lu et al 2008)。另外，近年来转录因子正逐渐被认为是一种能有效地调控植物次生代谢途径的新手段。通过超量表达转录因子，能够有效地克服多基因共转化存在的弊端，全面上调能被其调控的相关基因的表达水平，对整个次生代谢途径的调控效果要比单纯依赖单个(或多个)结构基因的增强表达好得多。例如van der Fits和Memelink(2000)在SCIENCE上报道发现一个受茉莉酸甲酯诱导并能够调控植物初级和次生代谢的中央转录调控因子ORCA3(Octadecanoie-responsive Cantharanthus AP2-domain  protein 3)，能增强TIAs生物合成代谢途径中绝大多数催化酶基因的协同表达，从而有效地调控长春花(Catharanthus roseus)中TIAs的生物合成，充分展示了用转录调节因子来调控TIAs生物合成的巨大潜力。ORCA3的发现为调控喜树碱的代谢合成提供了一种新的研究切入点。必须指出的是转录因子并非万能的，单转化一个ORCA3基因，虽然可以调控诸如AS，TDC，DXS，CPR和STR等多个关键酶基因的协同表达，但是有些基因如关键酶基因G10H并不受ORCA3的调控。在ORCA3基因过量表达的细胞中由于关键酶基因G10H的表达不足，从而限制了TIA代谢终产物如长春碱的产量没有得到显著提高。

发明内容

本发明的目的在于克服常规技术中的不足，提供一种有效提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法。

本发明还提供了实现上述方法的重组载体。

本发明利用已克隆的长春花CrORCA3和CrG10H基因，构建含上述基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌(如C58C1等)为介导，将CrORCA3和CrG10H基因同时导入喜树下胚轴中并再生出毛状根；PCR和荧光定量PCR检测目的基因CrORCA3和CrG10H的整合和表达情况，高效液相色谱测定喜树转基因毛状根中喜树碱含量。

技术方案为：一种用于提高喜树碱含量的重组载体，含有转录因子基因CrORCA3和香叶醇-10-脱氢酶基因CrG10H。