[发明专利]一种融合蛋白TAT-OCT4及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白TAT-OCT4及其编码基因与应用。

背景技术

OCT4与NANOG是参与胚胎干(ES)细胞多能性维持和自我更新的两个核心转录因子。同时也在体外诱导成体细胞向诱导性多潜能干细胞(iPS cell)重编程过程中起着关键作用。在早期的iPS细胞诱导研究中，大都采用病毒转染等基因修饰的方法，但此方法存在着很大安全隐患。在09年底有文献报道，利用多精氨酸蛋白跨膜肽与诱导因子OCT4，SOX2，c-MYC，KLF4也可以成功的诱导出人类和小鼠的iPS细胞。但是目前关于单独诱导因子在重编程中功能的研究很少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种融合蛋白，命名为TAT-OCT4。

本发明提供的融合蛋白，包括TAT跨膜肽以及结合在所述TAT跨膜肽的氨基端或羧基端的细胞重编程相关因子；

所述细胞重编程相关因子为OCT4转录因子、c-myc因子、klf4因子或SOX2因子；所述OCT4转录因子的氨基酸序列如序列表中序列6所示。

上述TAT跨膜肽是如下1)或2)所述的多肽：

1)序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的多肽；

2)序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的N末端和/或C末端加上1-10个任意氨基酸残基且具有跨膜功能的由1)衍生的多肽；

所述TAT跨膜肽2)是如下a)或b)或c)：

a)在序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的C末端加上序列表中序列4所示的HA标签；

b)在序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的N末端加上His标签；

c)在序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的C末端加上序列表中序列4所示的HA标签并在序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的N末端加上His标签。

进一步，上述蛋白是如下I)或II)的蛋白质：

I)其氨基酸序列如序列表中序列8的第22-403位所示；

II)其氨基酸序列如序列表中序列8所示。

上述的蛋白的编码基因属于本发明的保护范围。

进一步讲，上述基因是如下1)或2)：

1)其核苷酸序列如序列表中序列7的第64-1212位；

2)其核苷酸序列如序列表中序列7所示。

含有上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

具体地讲，上述重组表达载体是将上述的基因插入载体pET-28a的多克隆位点得到的载体。

上述的蛋白或上述的基因在制备如下(1)-(4)中任一所述产品中的应用：

(1)促进细胞向诱导性多潜能干细胞转变的产品；

(2)促进细胞增殖的产品；

(3)促进细胞中内源NANOG转录因子或OCT4转录因子表达量增强的产品；

(4)促进细胞中细胞周期蛋白表达量增强的产品。

上述NANOG转录因子的氨基酸序列如序列表中序列10所示；所述NANOG转录因子的编码基因如序列表中序列9所示；所述细胞周期蛋白是CDC25A或CDK6。

上述细胞是成纤维细胞；优选是是HAF细胞

实施例5证明：HAF细胞内源性的OCT4和NANOG的转录均可被外源加入的TAT-OCT4和TAT-NANOG融合蛋白所激活。TAT跨膜肽输送核转录因子蛋白可作为一个细胞重编程的方法，将在iPS细胞诱导和临床上具有重要的应用前景。可见，我们制备的导肽融合蛋白TAT-OCT4和TAT-NANOG均可以激活成纤维细胞内源的OCT4与NANOG表达，这也反应了在iPS重编程过程中转录因子OCT4和NANOG的自我调控与相互调控。而且TAT-NANOG可以在体外显著的提高细胞的增殖速度，这样为细胞的体外扩增及组织工程的临床应用提供了一种更加可控，更加安全的有效途径。

附图说明

图1为目的蛋白结构示意图，及其表达纯化的SDS-PAGE电泳检测与western blot鉴定；A，融合蛋白结构示意图；B，目的蛋白表达的SDS-PAGE电泳检测：1，Marker；2，5，空白对照的上清液和包涵体沉淀；3，6，TAT-OCT4表达菌株的上清液和包涵体沉淀；4，6，TAT-NANOG表达菌株的上清液和包涵体沉淀；C，D，分别为TAT-NANOG和TAT-OCT4的镍柱纯化及western blot鉴定。

图2为免疫荧光的方法对TAT融合蛋白的跨膜效率检测。

图3为TAT-OCT4和TAT-NANOG细胞内转录活性检测。