[发明专利]AaPMT和AaTRI双基因共转化提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法，特别是一种利用双关键酶基因共转化代谢工程策略提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量的方法。

背景技术

托品烷生物碱(tropane alkaloids)，又称莨菪烷生物碱，包括：莨菪碱(hyoscyamine)、山莨菪碱(anisodamine)东莨菪碱(scopolamine)、和樟柳碱(anisodine)。托品烷生物碱的临床各科应用越来越广泛，它是一类作用于副交感神经系统的抗胆碱药，具有麻醉、解痉、止痛、抗休克的功能。此外，它还具有改善微循环的作用，临床可用于治疗微循环障碍性疾病；还可用来治疗青光眼等。山莨菪碱和樟柳碱除了作用域副交感神经系统。在大鼠中，还对油酸所引起的急性肺损伤和急性肾衰时肾微血管的损伤具有保护作用。但是，由于资源植物体内托品烷生物碱的产量非常低，其供给量远远不能满足药用市场的需求。尤其是东莨菪碱，由于其对中枢镇静比较强，在商用市场中，对东莨菪碱的需求量是莨菪碱的10倍，但在资源植物中东莨菪碱的含量又远比莨菪碱低，所以东莨菪碱的价格远高于莨菪碱 (高10倍多)。

野生资源植物有限，过度开采容易造成生态失衡。多年来，世界各国科学家围绕着如何扩大托品烷生物碱的药源问题进行了大量研究。目前，莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱和樟柳碱均可以通过化学方法合成，但化学合成的方法存在工艺流程复杂、成本高及易造成环境污染等问题；传统育种方法所需的周期太长；细胞培养则存在托品烷生物碱含量低微及稳定性差等问题。但是毛状根技术在近些年成为了生产植物次生代谢物的一种比较新的途径。通过发根农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染植物而生成的毛状根具有很多优点：比如毛状根具有药用植物遗传背景，所以具有相似的代谢特征，能够稳定生产次生代谢物，有时甚至比植株本身的含量更高；同时毛状根生长速度快，不需外源激素，在连续继代培养的情况下能保持遗传性稳定。毛状根的可以通过生物反应器进行大规模的培养；还可以再生为完整的植株，由发根再生的植株同样具有遗传稳定性。

药用植物三分三(Anisodus acutangulus)，为茄科多年生草本植物，主要分布于我国云南西北部丽江。通过高效液相色谱检测，其根部含有大量的托品烷生物碱，据报道野生三分三干燥品总生物碱含量高达1.2％，所含生物碱含量比世界上一些常用的茄科植物如颠茄、莨菪曼陀罗等均高的多，且三分三所含生物碱绝大部分是莨菪烷类生物碱。三分三作为解痉镇痛的中草药在云南民间使用已有三四百年的悠久历史，然而由于大量采摘，野生资源已十分匮乏。因此，三分三是一种既重要又匮乏的产莨菪烷生物碱的优质资源植物。

目前，莨菪生物碱的基本代谢途径已经研究得比较清楚。与其他产莨菪烷生物碱植物如莨菪等相似，三分三中的莨菪碱也是由精氨酸和鸟氨酸经腐胺(Putrescine)衍生而来的。在整个莨菪烷生物碱合成过程中，腐胺N-甲基转移酶(Putrescine N-methyltransferase，PMT)和托品酮还原酶I(Tropinone reductase I，TRI)是两个关键的催化酶，是托品烷生物碱代谢工程的重要靶点。它们通过一系列的催化作用最终生成莨菪醇，使得莨菪醇沿主路途径最终生成目标活性物质莨菪生物碱。将上述的两个关键酶基因AaPMT和AaTRI共转化三分三，将打破托品烷生物碱生物合成途径的瓶颈效应，获得高产托品烷生物碱的三分三毛状根或植株，为商业化大量生产托品烷生物碱提供了可能，更为药品价格的降低提供了可能。迄今为止，国内外从三分三中分离克隆双关键酶基因并且通过共转化策略来提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量的研究尚鲜见报道。因此，本发明在实际解决托品烷生物碱药源紧缺性的问题上具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服常规技术获得托品烷生物碱中的不足，提供一种有效提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量的方法。

本发明还提供了实现上述方法的重组载体。

一种用于提高脱品烷生物碱含量的重组载体，含有腐胺N-甲基转移酶基因和托品酮还原酶I基因。

本发明应用双关键酶基因共转化策略提高三分三毛状根托品烷生物碱含量的方法，采用基因工程方法，将双关键酶基因(AaPMT，AaTRI)导入三分三外植体中，通过发根农杆菌的侵染获得了高产托品烷生物碱的三分三毛状根株系。