[发明专利]一种人源性无血清培养基及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学实验用品，尤其是涉及一种人源性无血清培养基及其制备方法。

背景技术

自建立组织和细胞培养技术起，就一直用含有动物或人血清的细胞培养基。在七十年代，生物学家就担心动物或人血清中的不确定物质对培养细胞的影响，特别是动物或人血清中病原体所带来的危险。随着干细胞研究的进一步发展，现已经可以将体外培养扩增的干细胞输入或移植于人体进行细胞替代治疗，因而非常有必要进行人源性无血清培养基的研制。我们在2007年就对人源性广细胞谱无血清培养基进行了查新并开始进行研究。

目前，国内外均无正式生产人源性无血清培养基的厂家。国外市售的无血清培养基均是含有动物来源的成分(如牛血清白蛋白等)的无血清培养基(简称动物源无血清培养基)，种类繁多，但一种无血清培养基仅针对某一、二种特殊类型的细胞，而且国外所有无血清培养基产品在说明书的标签上均注明“仅供研究用”，国外还有培养人胚胎干细胞和人成体干细胞的培养基，如StemPro-SFM，StemSpan H3000和KNOKOUT血清替代物，以及培养人造血干(祖)细胞和淋巴细胞的无血清培养基，如AIM-V和X-VIVO，但其中都含有动物源成分，没有药物级成分。虽然国内已有无血清无蛋白培养基(双无培养基)，其用植物种子蛋白水解产物代替动物源蛋白，但仅用于动物细胞培养，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、杂交瘤细胞等，不适用或不能用于人体细胞培养。随着细胞治疗的开展和临床应用，国内外在无血清培养基研发上的发展趋势是制备人源性无血清培养基，应不含有动物源蛋白质或其它物质，可供临床使用。动物源无血清培养基不宜用来培养用于临床治疗细胞的原因是：动物源无血清培养基中含有从牛或其他动物血清或组织中分离纯化的物质，可能含有动物病原体，如牛血清中含有牛病毒，这就造成这些动物病毒引起疾病的危险。近年来发现牛海绵型脑病(BSE)，即一种可传染的由牛病毒引起的牛神经变性性疾病，具有很长的潜伏期或培养时间，这一发现进一步使人们增加了在生物活性产品生产过程中使用动物血清的担心。为此，研制人源性无血清培养基势在必行，目前国内外尚无商品化的人源性无血清培养基。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种所添加的蛋白质和脂类，均来源于人的血浆、血清或组织、为药物级或高度纯化的人源蛋白或人重组蛋白、不含任何动物源成份，其它成分均符合美国药典或《国家标准化学试剂》或《中华人民共和国药典》2010年版第二部的超纯或分析纯试剂，并经细胞培养检测合格，用于临床安全合理的人源性无血清培养基。

本发明的第二个目的在于提供一种人源性无血清培养基的制备方法。

本发明的第一个目的是这样实现的：

一种人源性无血清培养基，特征是：配方含有以终浓度计的治疗用人血清白蛋白溶液1--10mg/ml、人重组胰岛素溶液4--40μg/ml、人转铁蛋白溶液30--60μg/ml、人胆固醇溶液20--50μg/ml、人过氧化氢酶溶液20--50μg/ml、2-巯基乙醇溶液0.5-5.0μg/ml、抗坏血酸溶液25--100μg/ml、亚油酸溶液1.5--25μg/ml、乙醇胺溶液10-60μg/ml、人玻连蛋白溶液1.0-10μg/ml、L-谷胺酰胺溶液10.0--100μg/ml。

本发明的第二个目的是这样实现的：

一种人源性无血清培养基的制备方法，特征是：

A.按常规方法配制浓度分别为的治疗用人血清白蛋白溶液50-500mg/ml、人重组胰岛素溶液500-2000μg/ml、人过氧化氢酶溶液1000-2500μg/ml、2-巯基乙醇溶液：25-250μg/ml、抗坏血酸溶液1250--5000μg/ml、乙醇胺溶液500-3000μg/ml、人玻连蛋白溶液50-500μg/ml、L-谷胺酰胺溶液500-5000μg/ml；

B、制备铁饱和的人转铁蛋白溶液：

(1)、先将16.22--27.30mg的FeCl₃用10--20ml的1mM HCl溶解，配成储存液，然后分装、冷冻保存于-20℃，得到1号储存液；

(2)、称取120--200mg的人转铁蛋白，溶于未加碳酸氢钠的4.0--10.0ml刀比科氏改良伊格氏(DMEM)中，再加入270--400μl的1号储存液，搅拌均匀，即得浓度为1500--3000μg/ml的铁饱和的人转铁蛋白溶液；