[发明专利]一种血浆中利巴韦林含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明属体内药物分析和药物代谢动力学领域，特别是涉及血浆中利巴韦林含量的测定方法。

背景技术

利巴韦林系广谱强效的抗病毒药物，为单磷酸次嘌呤核苷脱氢酶抑制剂，抑制IMB转变为鸟苷酸，阻碍病毒核酸合成，阻止病毒复制和传播，从而达到抗病毒的作用。对多种RNA和DNA病毒均有明显的抑制作用，对HIV病毒也有较强的抑制作用。利巴韦林副作用少，不良反应发生率低，根据其药理作用，使用时要注意大剂量长期使用引起的白细胞减少、贫血、血清转氨酶和胆红素升高等现象，为保证临床用药安全有效，血浆中利巴韦林含量的测定极其重要。到目前为止，有关利巴韦林含量的测定方法繁多，诸如紫外光谱法、高效液相色谱法(HPLC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、旋光法、比色法、高效毛细血管电泳法(HPCE)、线性扫描极谱法和高碘酸法等，较少见有LC-MS法测定利巴韦林含量的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的利巴韦林含量测定方法，该方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中利巴韦林的浓度，灵敏度较高，为保证药品质量控制及临床合理用药提供依据。

本发明解决的技术问题通过以下技术方案来实现：

血浆中利巴韦林含量的测定方法包括下列步骤：

(1)血浆样品预处理

a.含有利巴韦林的血浆，先加入内标溶液(6-甲基烟酸)混匀，再加入甲醇涡旋混匀后离心，取上层澄清溶液于35℃水浴中以氮气流吹干，用流动相复溶，涡旋后加入氯仿，涡旋静置后离心，吸取上层澄清溶液；

b.流动相复溶后用LC-MS法检测；

(2)LC-MS检测方法

色谱条件：色谱柱：Sepax HP-C18，dp 3μm，2.1×100mm，柱温：30℃，流动相：30mmol/L醋酸铵水溶液(含0.2％的甲酸)，流速：0.2ml/min；质谱条件：离子检测方式：选择性离子检测(SIM)，离子极性：正离子(Positive)，离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(ESI)。

所述步骤(2)气助电喷雾离子源，采用正离子模式，传输电压为120V，干燥气流速为8L/min，雾化室压力为40psig，干燥气温度为350℃，用于定量分析的检测离子分别为m/z 267.0([M+Na]⁺，利巴韦林)和m/z 138.1([M+H]⁺，内标6-甲基烟酸)。

本发明特色之一是使用氯仿作为清除蛋白和内源性杂质的试剂，可以消除测定血浆中的内源性杂质干扰。本发明具有良好的回收率和精密度，简便快捷，不受制剂中其他成分的干扰，符合生物样品分析要求，可灵敏测定人体血浆中利巴韦林含量，适合用于利巴韦林药代动力学研究。

本发明为确保血浆样品测定结果的有效可信准确，在每批血样测定时均随机加入并平行测定低、中、高3个浓度(20、200和1200μg/L)的标准质控样品各2份，共测试了12个分析批样品，每一分析批质控测定结果误差百分率均小于±15％，符合体内药物分析要求。

附图说明

图1利巴韦林的质谱扫描图。

图26-甲基烟酸的质谱扫描图。

图3空白血样色谱图。

图4利巴韦林标准品色谱图。

图5内标6-甲基烟酸对照品色谱图。

具体实施方式：

人体血浆中利巴韦林含量测定方法，是在含药血浆中先加入内标溶液(6-甲基烟酸)混匀，再加入甲醇涡旋混匀后离心，取上清于35℃水浴中以氮气流吹干，用30mmol/L醋酸铵水溶液(含0.2％的甲酸)的流动相复溶，涡旋后加入氯仿，涡旋静置后离心，吸取上层澄清溶液，即可用LC-MS测定(色谱条件：色谱柱：Sepax HP-C18，dp 3μm，2.1×100mm，柱温：30℃，流动相：30mmol/L醋酸铵水溶液(含0.2％的甲酸)，流速：0.2ml/min；质谱条件：离子检测方式：选择性离子检测，离子极性：正离子，离子化方式：气动辅助电喷雾离子化)。

测定结果：标准曲线：取空白血浆0.2ml，加适量利巴韦林标准溶液，配制成相当于利巴韦林血浆浓度为10、30、100、300、600、1000和1500μg/L的溶液，按照测定步骤操作，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(权重系数w＝1/C×C)最小二乘法进行回归运算，求得回归方程为：f＝0.008268+0.1257×C，r＝0.9992，血浆中利巴韦林的最低定量限为10μg/L。本发明精密度：取空白血浆加入适量的利巴韦林标准溶液，分别配成低、中、高3个浓度的样品(20、200和1200μg/L)，按样品测定方法日内重复测定5次，日内RSD分别为5.1％、3.1％和3.2％。同法配制的3个浓度样品连续测定3天，每一浓度重复测定5次，日间RSD分别为5.5％、5.5％和3.3％。本发明提取回收率：取空白血浆加入适量的利巴韦林标准溶液，分别配成低、中、高3个浓度的利巴韦林(20、200和1200μg/L)，按样品测定方法重复测定5次，以实测值与理论值之比计算回收率分别为81.4％、78.0％和82.3％，平均回收率为80.6％。