[发明专利]一种重组大肠杆菌及应用其以单一碳源生产PHBV的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组大肠杆菌及其生产生物可降解塑料的方法，尤其涉及一种产PHBV(聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)的重组大肠杆菌及其利用廉价的单一的简单碳源生产PHBV的方法，属于基因工程和微生物发酵领域。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoat，简称PHA)，是由微生物合成的功能性生物聚酯。PHA具有生物可降解性、生物相容性、气体阻隔性、压电性、非线性光学活性以及由官能团引起的其它特殊性能。PHA的性质决定了它具有可作为生物可降解塑料、组织工程的支架材料等许多潜在的应用前景，因此，国内外都对其进行大量的基础和应用开发研究。

PHBV是PHA聚合物家族中的一员，它是由3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基戊酸(3HV)两种短链单体聚合而成的一类高分子化合物。PHBV与均聚物PHB相比，其性能更接近于石化来源的聚乙烯塑料。PHB的化学结构决定了它的高结晶度(60～80％)，因而硬且脆，断裂延伸率很低；而且PHB在加热温度高于熔点(180℃)10℃以上时，就会裂解，从而增加了PHB的加工处理难度。针对这些缺点，渗入3HV单体使得共聚物PHBV的结晶度下降，相应的硬度下降，但强度提高，韧性增强；并且PHBV的熔点随着3HV单体浓度的增加而下降，但PHBV分子的分解温度却没有相应下降。PHBV的优良性能决定了它相对于PHB具有更为广泛的用途。随着世界范围内能源危机的加剧、以及环境保护意识的增强，PHBV类材料的开发以及利用已引起了科研领域以及工业界的广泛兴趣。

从PHBV的合成途径可以看出，细胞中丙酰辅酶A的含量直接决定PHBV中3HV单体的含量。一般来说，要在细胞中合成PHBV，除了以葡萄糖作为主要碳源外，还必须向发酵液中加入含有奇数碳的辅助碳源，作为合成丙酰辅酶A的前体，如丙酸、戊酸、正戊醇等。在利用重组大肠杆菌合成PHBV的相关报道中，绝大部分都是利用丙酸作为PHBV合成的辅助碳源。但是，丙酸作为应用最广泛的PHBV合成的前体物，在PHBV生产中也存在一定的缺点：1)与常用的简单碳源(如葡萄糖)相比，丙酸的价格较贵，增大了PHBV的生产成本；2)丙酸是一种毒性较高的化合物，会抑制细胞的生长。因此，在传统的PHBV的发酵生产上都要严格控制丙酸的浓度以防止其抑制细胞生长。

利用廉价的简单碳源(如葡萄糖)合成PHBV，可以解决PHBV生产成本过高及传统的生产过程控制较为复杂的问题。因此，微生物利用单一的简单碳源合成PHBV成为近年来研究的热点。在早期的研究中，研究者们分别在Alcaligenes eutrophus和大肠杆菌中实现了利用葡萄糖等简单碳源合成PHBV。但是，这些尝试获得的PHBV产物中3HV的摩尔分数都较低，无法满足工业材料的需要。最近，Aldor等人在重组Salmonella enterica SerovarTyphimurium中构建了一条利用甘油合成PHBV的途径，可以获得3HV摩尔分数达到30％以上的PHBV共聚物。然而，该方法在生产过程中，需要向培养基中加入昂贵的CN-B₁₂，从而增加了PHBV的生产成本。

自然界中存在某些微生物能够利用单一碳源直接合成PHBV。例如诺卡氏菌属(Nocardia)或红球菌属(Rhodococcus)中的某些野生菌能够利用葡萄糖为单一碳源合成3HV高含量的PHBV共聚物(3HV摩尔分数可达到75％以上)。这些野生菌用于合成3HV的丙酰CoA来源于2-甲基丙二酰CoA途径，该途径能够将TCA循环和PHBV合成途径联系到一起。

而上述野生的PHBV产生菌一般对营养要求较高，生长速度较慢，聚合物需要在营养不均衡的条件下产生，且回收困难，不利于大规模生产。

大肠杆菌(Escherichia coli)遗传背景清楚，底物利用范围广，生长速度较快，易于大规模培养，且细胞容易破碎，是理想的PHBV生产菌种。然而，申请人在相关的检索中发现，通过基因工程技术构建重组大肠杆菌，利用葡萄糖、木糖等单一碳源经苏氨酸合成途径生产PHBV，解决传统PHBV生产上成本过高和控制策略相对复杂问题的专利和文献还未见报道。

发明内容

针对现有技术中利用丙酸合成PHBV成本过高及控制策略过于复杂的问题，本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌并利用所述重组大肠杆菌以单一碳源生产PHBV的方法。