[发明专利]一种重组大肠杆菌及应用其以单一碳源生产PHBV的方法

权利要求书

1.一种产聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌名为重组大肠杆菌QW103PT，由如下方法制得，即：以基因工程技术敲除大肠杆菌中的prpC基因，得到大肠杆菌QW100；再在菌株QW100中敲除scpC基因得到大肠杆菌QW102；再进一步在菌株QW102中敲除pta基因，获得基因型为E.coliΔprpCΔscpCΔpta的大肠杆菌QW103；然后将来源于大肠杆菌MG1655的已将thrA基因1034位的C碱基突变为T碱基的thrABC基因簇插入到载体pCL1920中，获得thrABC基因表达载体pCL-thrABC，将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutropha)中的phbCAB基因簇以及来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的ilvA基因依次插入到载体pBluescript SK^-中，获得PHBV合成酶和苏氨酸脱氨酶双表达载体pHB-ilvA；最后将获得表达载体pCL-thrABC和pHB-ilvA分别转化进入大肠杆菌QW103中，得到产聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)的重组大肠杆菌菌株QW103PT。

2.如权利要求1所述产聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)的重组大肠杆菌，其特征在于，所述出发菌株大肠杆菌选大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109、大肠杆菌W3110或大肠杆菌XL1-Blue。

3.如权利要求1所述产聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)的重组大肠杆菌，其特征在于，所述出发菌株大肠杆菌选大肠杆菌DH5α。

4.权利要求1所述重组大肠杆菌在利用单一碳源生产聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)中的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌应用的方法是：

(1)菌种选择：重组大肠杆菌QW103PT；

(2)平板培养：将重组大肠杆菌QW103PT菌种接种于含有质量百分比为1.5～2.0％的琼脂并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄霉素和25～75微克/毫升的壮观霉素的固体LB培养基平板上，25～42℃条件下，静置培养8～16小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100毫升并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄霉素和25～75微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，25～42℃条件下，150～250转/分钟摇床振荡培养8～16小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以体积比为5～15％的的接种量，将步骤(3)的种子液接种于200～1000毫升并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄霉素和25～75微克/毫升的壮观霉素的LB液体培养基中，25～42℃条件下，150～250转/分钟振荡培养8～16小时，制得扩大量的培养菌液；

(5)发酵培养：以5～15％的体积比的接种量，将步骤(4)所述培养菌液接种于含培发酵养基工作体积为2.5～3.5升的5升发酵罐中，其中发酵培养基是加有终浓度为50～150微克/毫升氨苄霉素和25～75微克/毫升的壮观霉素的M9培养基；然后向发酵培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并使其终浓度达到0.2～0.6毫摩尔/升；在25～40℃下诱导培养1～3小时使菌体OD₆₀₀达到1～2，之后向菌液中加入碳源，使菌液中的总糖含量达到5～30克/升，维持pH值在5.5～9.0，搅拌转速为100-500转/分钟，25～42℃条件下，发酵培养24～72小时；

(6)收集细胞：发酵结束后，将发酵液在5,000转/分钟的转速下离心10～30分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2～3次后，再5,000转/分钟离心10～30分钟收集细胞；

(7)聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)提取：取步骤(6)所得的细胞置于-70℃冰箱中12～30小时，然后在冻干机中冻干；向获得的干菌体中加入其8～10倍体积的丙酮，50～60℃处理20～60分钟后，过滤除去丙酮，烘干；然后加入干菌体8～10倍体积的氯仿，40～60℃浸提1～3小时后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(PHBV)产物。