[发明专利]一种核酸的检测方法和一种试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸的检测方法，一种采用该方法进行核酸检测的试剂盒，及所述检测方法和所述试剂盒在检验检疫中的应用。

背景技术

分子诊断是现代生物分析的前沿技术，检测特定核酸序列是生物分析的重要内容。常规的分子鉴定有多种技术方法，如荧光定量PCR(Qi Y.Appl Environ Microbiol，2001，67(8)：3720-3727)、RFLP(限制性酶切片段长度多态性，S.R.Klee.J.Applied Microbiology.2006，100，1364-5072)、基因芯片、测序等。但这些方法操作复杂，一般需借助大型昂贵的仪器设备，耗时较长，难以普及推广。对于需要快速鉴定诊断的某些致病性微生物(生物武器)，如炭疽杆菌，尤其难以满足需要。因此，发展一种快速便捷、廉价高效、不需要复杂设备，为医护现场提供诊断的分析手段具有非常重大的现实意义。

金纳米颗粒(AuNP)是直径为1-100nm的胶体，其以良好的稳定性、小尺寸效应、表面效应、量子效应、光学效应以及独特的生物亲和性，广泛用于光学、电学、成像的生物分子标记(HorisbergerM.Scanning Electron M icroscopy II，1981：9-31)。金纳米颗粒具有很高的消光系数，颗粒直径为13nm的金纳米颗粒在520nm波长左右有尖锐的吸收峰，其自组装聚集导致吸收峰明显改变，这种表面等离子共振效应(SPR，Surface Plasmon Resonance)可显示颜色的变化。同时，金纳米颗粒具有广泛的生物亲和性，DNA分子可以偶联到金纳米颗粒上，参与其自组装过程，最终影响金纳米颗粒溶液(或称胶体金溶液)的物理特性，如颜色、吸光度等。Mirkin发现通过DNA特异性杂交可使AuNP-DNA颗粒自组装团聚，进而出现胶体溶液颜色的变化，从而开创了AuNP用于生物检测的先河(Mirkin C A.Nature，1996，382(6592)：607-609)。AuNP与巯基修饰的短链DNA偶联成为检测探针，当溶液中存在长短一致的目标互补DNA时，金纳米颗粒发生有序、可逆的团聚反应，形成二维、三维的网状团聚结构，颜色可从宝石红色变成紫蓝色(Elghanian R.Science，1997，277(22)：1078-1081)。这种聚集后溶液颜色从宝石红到紫蓝色的肉眼可观察的颜色变化为生物分析检测提供了一种快速、简便的方法，AuNP在生物检测中显示诱人的应用前景。

ssDNA(单链DNA)和dsDNA(双链DNA)对AuNP具有不同的吸附能力，ssDNA可吸附至带负电荷的金纳米颗粒表面，吸附ssDNA的AuNP处于稳定状态，免受电解质盐离子引起的聚集反应(Li H.PNAS，2004，101(39)：14036-14039)，Li据此设计AuNP聚集反应的核酸杂交比色检测方法。针对心率失常相关靶基因，先进行常规的PCR，获得双链产物。随后加入胶体金溶液及一定的探针(probes)，变性退火。如有特异性靶核酸的扩增，胶体金溶液由宝石红色变成紫蓝色，反之，保持其原来宝石红色(Li H.J.Am.Chem.Soc.，2004，216：10958-10961)。此法是一种核酸检测新思路，非交联的方式不需要对AuNP和探针进行共价修饰。但实际操作中，探针与PCR产物的比例不易掌握，对未知浓度样本需要大量事先测试或对PCR产物纯化、定量，从而难以实际推广应用。

近来，利用金纳米颗粒的SPR效应与PCR技术的结合产生了一种Nano-PCR的检测方法。Cai利用寡核苷酸探针偶联金纳米颗粒，替代常规引物，利用PCR技术对HIV gp140的外显子序列进行扩增。通过肉眼比色进行检测，快速简便(Miao Cai.Nano Res.2010，3：557-563)。但由于技术方法本身的局限性，颜色变化并不明显，实际应用性有限。

因此，需要开发一种简便易行、颜色变化明显的核酸检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种快速简便、肉眼即可观察到显著颜色变化的核酸检测方法及利用该方法进行核酸检测的试剂盒和该方法与该试剂盒在检验检疫中的应用。