[发明专利]一种核酸的检测方法和一种试剂盒及应用

权利要求书

1.一种核酸的检测方法，其特征在于，该方法包括提供待测核酸，在不对称PCR的反应条件下，在PCR缓冲溶液中，使待测核酸与能够扩增靶核酸的一对引物、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸接触，将接触所得产物与含有探针分子的液体混合，通过观测得到的混合物的颜色或颜色变化，判断待测核酸中是否含有靶核酸。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，不对称PCR的反应条件包括，预变性温度为90-98℃，变性温度为90-98℃，退火温度为40-60℃，延伸温度为70-75℃，循环数大于10；所述能够扩增靶核酸的一对引物包括限制性引物和非限制性引物，且限制性引物和非限制性引物的摩尔比为1∶5-240。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其中，循环数为30-40；且限制性引物和非限制性引物的摩尔比为1∶10-100。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的检测方法，其中，以所述接触所得产物的体积为基准，所述PCR缓冲溶液加入的体积为5-50％，且PCR缓冲溶液的pH值为8.5-9.5，所述待测核酸的加入量为0.001-1000nM，所述DNA聚合酶的加入量为0.01-0.2U/μL，所述三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸各自的加入量为50-500μM，所述能够扩增靶核酸的一对引物的加入量为0.1-5μM。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其中，以所述接触所得产物的体积为基准，所述待测核酸的加入量为1-300nM，所述DNA聚合酶的加入量为0.01-0.1U/μL，所述三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸以及三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸各自的加入量为100-300μM，所述能够扩增靶核酸的一对引物的加入量为0.3-3μM。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的检测方法，其中，将接触所得产物与含有探针分子的液体混合在无机盐MX存在下进行，M为Na和/或K，X为Cl、Br或I中的一种或多种，无机盐MX的加入量使得所述混合物中无机盐MX的浓度为0.5-1.5摩尔/升。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的检测方法，其中，将接触所得产物与含有探针分子的液体混合的条件包括，温度不低于10℃，时间为1-60分钟。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的检测方法，其中，以所述混合物的体积为基准，所述含有探针分子的液体中探针分子的浓度为500-1500nM。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的检测方法，其中，所述含有探针分子的液体中的探针分子包括多种偶联物，每种偶联物由一种纳米颗粒与一种或多种寡核苷酸形成，每种寡核苷酸中的至少部分均与靶核酸的一条链的一部分互补。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其中，所述含有探针分子的液体中的探针分子包括两种偶联物，每种偶联物为一种纳米颗粒与一种寡核苷酸的偶联物，两种偶联物中的纳米颗粒相同，寡核苷酸不相同，且两种偶联物的摩尔比为1∶0.8-1.2。

11.根据权利要求9或10所述的检测方法，其中，所述寡核苷酸的长度为10-50个核苷酸。

12.根据权利要求9-11中任意一项所述的检测方法，其中，所述偶联物中的纳米颗粒的颗粒直径为5-100纳米。

13.根据权利要求9-12中任意一项所述的检测方法，其中，所述偶联物中的纳米颗粒为金纳米颗粒。

14.根据权利要求1-13中任意一项所述的检测方法，其中，所述靶核酸为炭疽杆菌、霍乱弧菌、鼠疫杆菌、野兔热杆菌、伤寒杆菌、布氏杆菌、天花病毒、黄热病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、班疹伤寒立克次体、肉毒杆菌毒素、鸟疫衣原体、肉毒杆菌毒素、葡萄球菌肠毒素、粗球孢子菌、荚膜组织胞浆菌中至少一种的基因组中的至少一部分。