[发明专利]CD8α-白介素21-CD137复合物扩增激活淋巴细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫学领域，具体是指使用CD8α-白介素21-CD137复合物转染的K562细胞和低浓度白介素2共同作用扩增激活自然杀伤细胞(NK)成为淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)细胞。

技术背景

1982年Grimm等首先报道外周血淋巴细胞中加入白介素2体外培养4-6天，能诱导出一种非特异的杀伤细胞，这类细胞可以杀伤多种对NK不敏感的肿瘤细胞。这类细胞被称为淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)。1984年11月Rosenberg研究组经美国食品和药品检验局(FDA)批准下，首次应用IL-2与LAK协同治疗25例肾细胞癌、黑素瘤、肺癌、结肠癌等肿瘤患者。其中11例肿瘤缩小超过50％，1例黑素瘤完全消退。1988年该研究组总结了IL-2与LAK细胞协同治疗222例肿瘤患者，其中16例患者肿瘤转移灶完全消退，26例患者肿瘤消退50％以上，该疗法对转移性肾细胞癌、黑素瘤、结肠癌和非何杰金氏淋巴瘤患者的疗效较显著。随后的研究表明LAK细胞对乳腺癌、膀胱癌，肝癌和急性白血病进行治疗也有明显疗效。目前LAK细胞治疗在美国主要用来和化疗、放疗联合使用。

LAK细胞数量与疗效直接相关，治疗中存在的问题是获得大量LAK细胞非常困难。通常采用的高剂量白介素2激活生长的方法能够扩增的倍数有限(100倍)，而且需要从病人身体中采集大量的外周血(500亳升)才能够初步达到治疗的剂量，这对病人是一个很大的生理负担。高剂量的白介素2费用昂贵，对病人又是很大的经济负担。目前的研究表明白介素2激活生长的LAK细胞倍数有限与白介素2扩增后的细胞端粒酶活性降低有关。端粒酶活性降低也可能是高剂量白介素2激活生长的LAK细胞输入病人体内后作用有限的重要原因。本发明解决了这一问题，本发明提供了一种可以在体外扩增和激活NK的方法。该方法所需的白介素2只有通常采用方法的十分之一，扩增的效率高10-100倍，扩增后的LAK细胞端粒酶活性是通常采用方法的五倍。用该方法扩增的LAK细胞比用通常采用的方法扩增的细胞纯度和活性显著增强，数量上可以达到临床治疗的需要，可以用来帮助病人抵抗肿瘤、病毒和细菌。

发明内容

本发明是通过下述技术方案得以实现的：

CD8α-白介素21-CD137复合物扩增激活淋巴细胞的方法，其特征在于：

(1)CD8α、白介素21和CD137是上述各蛋白质的全部多肽或是包括上述各蛋白质中具备功能的多肽成分；

(2)CD8α-白介素21-CD137复合物采用蛋白稳定表达系统，其中细胞系转录了稳定表达CD8α-白介素21-CD137复合物的表达载体，载体中含有病毒启动子和选择标记基因；

(3)外源表达载体进入宿主K562细胞后，激活启动子，培养细胞后即可得到表达跨膜白介素21-CD137复合物的细胞；宿主K562细胞经过酸、碱或辐照后即得到用来扩增淋巴细胞的跨膜白介素21-CD137复合物；

(4)把跨膜白介素21-CD137复合物依次用：硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石色谱法，色谱法和凝集素进行纯化，即得纯化复合物；纯化复合物可以用来扩增激活淋巴细胞生成LAK细胞。

作为优选，上述方法中所述的白介素2、白介素21和CD137从人体分离的细胞。

作为优选，上述方法中所述的扩增的淋巴细胞是外周血淋巴细胞、纯化的NK细胞、纯化的NK细胞和外周血淋巴细胞的组合、纯化的NK细胞或外周血淋巴细胞和别的淋巴细胞的组合、或白介素2和/或白介素21和/或CD137混合物注射进人体血管后作用的血液中所有白细胞；

其中纯化是指NK细胞代表总数的50％以上。

作为优选，上述方法中所述的培养液为：Eagle’s培养液加入10％人血清或10％小牛血清；或RPMI1640加入10％人血清或10％小牛血清；或F-10(Ham’s)Nutrient mixtures加入10％人血清或10％小牛血清。

作为优选，上述方法中所述的跨膜白介素21-CD137复合物的剂量在50pM～1nM；其中K562细胞与淋巴细胞的用量比例如下为，K562细胞∶淋巴细胞＝1～10∶1；作为更佳选择，所述的K562细胞中加入跨膜白介素21-CD137复合物；K562细胞∶淋巴细胞＝1～4∶1。