[发明专利]山羊TNNT3基因及克隆山羊TNNT3基因编码区全序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种山羊TNNT3基因及克隆山羊TNNT3基因编码区全序列的方法。

背景技术

快肌肌钙蛋白(TNNT3)是存在于骨骼肌中的钙离子结合蛋白复合物成员之一。肌钙蛋白T(TNT)与肌钙蛋白C和肌钙蛋白I一起形成三元肌钙蛋白复合物，在肌肉的收缩和舒张中起着关键作用。TNNT3是一种非对称性蛋白质，伴有一球形C端功能区，它有一个与原肌凝蛋白结合的位点，是负责将肌钙蛋白复合物与原肌凝蛋白相结合的蛋白质。协调肌丝的钙离子浓度依赖性ATP酶活性，从而在肌细胞收缩和舒张过程中发挥作用。

目前还没有山羊TNNT3基因的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种克隆山羊TNNT3基因编码区全序列的方法，以及山羊TNNT3基因的完整编码区序列。采用如下技术方案：

山羊TNNT3基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

所述的山羊TNNT3基因，所述基因的编码区序列为SEQ ID NO：2。

所述的山羊TNNT3基因，所述基因的编码区序列编码氨基酸为SEQ ID NO：3。

所述的山羊TNNT3基因的克隆方法，包括如下步骤：

步骤一 提取山羊腿肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；

步骤二 引物的设计及PCR反应；依据已发表的牛的TNNT3基因的序列设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；所述简并引物为：

上游引物P1：5′-CAGCCGTAGAAAGCACC-3′

下游引物P2：5′-CACTCTACTTCCAGCACCC-3′

用所述cDNA为模板进行梯度PCR反应；

步骤三 PCR产物的回收和纯化；

步骤四 克隆。

所述的方法，所述步骤二中，所述PCR反应体系为：PCR反应体系为50μl体系：25μL的2×Master Mix Tap，上下游引物各2.5μL，10μL的cDNA，10μL的ddH₂O；反应条件为95℃预变性5min，35个循环(94℃，40s；53，40s；72℃，50s)，最后72℃10min。

本发明简单、快捷的获取了山羊TNNT3基因的完整编码区序列，填补了该基因在山羊上的空白，为进一步研究山羊的该基因奠定了基础。

该技术相比较分段克隆和RACE技术而言，目的PCR片段的长短大致明确，工作量小(只需克隆一次)，具有成本低，效率高的优势。

附图说明

图1是TNNT3基因克隆阳性菌的普通PCR产物电泳图。

图2是山羊TNNT3基因编码区的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

步骤一 提取山羊腿肌组织中的总RNA(核糖核酸)，然后将总RNA反转录成cDNA；

1.组织的采集

选取周岁的天府肉羊颈动脉放血后立即取约1g腿肌放入液氮罐中用于提取总RNA

2.RNA的制备及cDNA的合成

在实验室用液氮将山羊腿肌磨成粉末装入1.5ml的EP管，放入零下80的超低温冰箱中备用。

取新的1.5ml的EP管，加入1.2ml的Trizol液，然后加入约80mg的腿肌组织粉末。立即用手摇晃混匀后，用震荡仪震荡约30秒后室温放置4分钟。

4℃下13500rpm离心3分钟将液体用移液枪转运到另一个新的1.5ml的EP管，并往这个新EP管中加入0.2ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管约15秒，然后4℃下13000rpm离心8分钟。离心结束以后用移液枪将这个EP管中的上层水相约0.5ml移入一新的离心管，加入0.5ml的异丙醇，室温放置10分钟，接着4℃下12000rpm离心10分钟。弃去上清液，加入1ml的75％乙醇(DEPC水配制)混匀，4℃下7500g离心5分钟。

小心弃去上清液，然后然后用移液枪吸干管壁上多余的乙醇，注意不要把RNA吸掉，然后根据RNA量的多少，加入50到150μL的DEPC水。用1.5％琼脂糖电泳法检测RNA的质量，将效果好的RNA立即反转录成cDNA。

步骤二 引物的设计及PCR反应；

依据已发表的牛的TNNT3基因的序列(登录号为NM_001001441)设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计。设计的引物为：