[发明专利]HIV-1表型耐药检测载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明充分利用分子克隆技术和位点重组原理，构建一个入门克隆和目的表达克隆。构成新型表型耐药检测系统。

背景技术

艾滋病抗病毒治疗的广泛应用显著延长了患者寿命，提高了患者的生活质量，大大降低了HIV/AIDS相关发病率和死亡率。但是HIV耐药性的出现却极大地限制了抗病毒治疗的效果。

HIV耐药不仅使患者抗病毒治疗的效果下降，甚至完全失败。HIV耐药株的出现和流行将带来严重的公共卫生问题：1)耐药导致的治疗失败使艾滋病死亡病例增加；2)更换“二线药物”导致治疗费用增加；3)HIV耐药株的传播。

HIV-1耐药检测不仅可以帮助公共卫生研究人员了解耐药毒株传播现状和趋势，以制定相应的公共卫生防治策略，还可以帮助临床医生选择有效地药物尤其是在对一线或二线药物治疗出现病毒学失败的病例，因此耐药检测无论是对耐药流行株的检测还是对艾滋病患者的关怀都是一种非常重要和有价值的方法。表型耐药检测能够直接定量评估HIV耐药情况，而且对于非B亚型和任何新的抗病毒药耐药均可评估。然而假病毒骨架载体分子很大，传统的表型耐药检测系统很难及时有效的将RT区耐药片段置换进去，致使检测时间长，不利于临床合理治疗方案的及时制定。基于此，我们必须依托我们实验室现有条件，发明出一种全新、高效和快速的HIV-1表型耐药检测系统。

发明内容

本发明目的在于构建利用位点重组HIV-1表型耐药检测载体，提高表型耐药检测效率。

本发明的另一目的在于提供上述载体构建方法。

本发明的发明思路基于下述两方面的考虑。第一，在艾滋病临床治疗工作中，表型耐药检测能够为艾滋病患者的治疗方案的制定提供重要依据。然而假病毒骨架载体分子很大传统的表型耐药检测系统很难及时有效的将RT区耐药片段置换进去，致使检测时间长，严重影响了耐药检测原有的效果；第二，Gateway^TM技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95％或更高。它主要是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统(attB x attP→attL xattR)。BP和LR两个反应就构成了Gateway^TM技术。BP反应利用一个attB DNA片段和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。基于上述原理，我们开发了一项新型表型耐药检测系统，它将大大缩短表型耐药检测时间，提高检测效率。

为了达成本发明上述目的，本发明采用如下具体技术方案：

HIV-1表型耐药检测载体，所述载体结构如图6所示。

所述载体的碱基序列如SEQ ID No.3所示。

一种上述的HIV-1表型耐药检测载体的构建方法，具体步骤如下：

(1)pcDNA6.2gw_miR载体(invitrogen公司，结构如图1所示)重建，利用限制性内切酶BamH1和BaglII切割pcDNA6.2gw_miR载体并重组加入gag-pol片段得到pcDNA6.2-gag-pol载体，所述pcDNA6-gag-pol结构如图2所示；

(2)pNL4-3载体(结构如图4所示)重建，利用Mscil限制性内切酶切割p NL4-3载体，删除原有pol区，自连形成缺失pol区的载体pNL4-3-1载体，利用限制性内切酶spe1和apa1切割plenti6 v5/dest(invitrogen结构如图3所示)得到ATTR片段，利用限制性内切酶spe1和apa1切割pNL4-3-1载体回收载体，将载体和ATTR片段定向连接，得到pNL4-3-ATTR载体，结构如图5所示；

(3)将pcDNA6.2-gag-pol质粒和pNL4-3-ATTR质粒经BP、LR反应后最终得到质粒pNL4-3-gag-pol，结构如图6所示；

(4)将上述pNL4-3-gag-pol与pcDNA3.1-ENV质粒共转染293细胞得到假病毒，假病毒感染Ghost细胞检测荧光素酶基因表达情况。

上述载体在制备HIV-1表型耐药检测试剂盒中的用途。

本发明的有益效果：