[发明专利]人膜联蛋白V变体及其表达、制备和应用

权利要求书

1.一种膜联蛋白V变体，具有序列表中序列1氨基酸残基序列的蛋白质，其特征在于：是序列1中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与序列1的氨基酸残基序列相同活性的由序列1衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的膜联蛋白V变体，其特征是在膜联蛋白V的C-末端添加一段具有柔性结构的、不含支链氨基酸的短肽，其中，短肽为1-25氨基酸残基，主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等不含支链的氨基酸组成，并含有1-3个半胱氨酸。

3.根据权利要求1所述的膜联蛋白V变体，其特征在于膜联蛋白V的C-末端添加一个半胱氨酸。

4.一种上述膜联蛋白V变体的制备方法，其特征在于：按如下步骤进行：

a.利用计算机辅助分子设计，在膜联蛋白V晶体结构的基础上，对膜联蛋白V的C-末端添加氨基酸序列进行分子模建和设计；

b.设计膜联蛋白V蛋白编码序列的引物对，以膜联蛋白V基因为模板进行PCR扩增；

c.PCR电泳回收产物与克隆载体连接并转入大肠杆菌感受态细胞Top10上进行培养；

d.用限制性内切酶Nco I和Xho I分别双酶切c步骤回收产物和表达载体pET28a，将得到的两种目的基因片段用T4DNA连接酶连接，转入大肠杆菌感受态细胞Top10进行培养并筛选提取重组表达质粒；

e.将所提取的重组表达质粒转入大肠杆菌表达宿主菌内，培养菌株得菌液，用IPTG诱导菌液，收集菌种；

f.将步骤e获得的菌种进行扩大培养，收集菌体；

g.将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化后的蛋白。

5.根据权利要求4所述的膜联蛋白V变体的制备方法，其特征在于：所述引物对的核苷酸序列为：

上游引物：5’-gtt cca tgg gcg cac agg ttc tca gag gca-3’；

下游引物：5’-tcc gct cga gtt agc agt cat ctt ctc cac aga gca-3’。

6.根据权利要求4所述的膜联蛋白V变体的制备方法，其特征在于：步骤g中纯化的步骤依次为沉淀解吸、硫酸铵分级沉淀、Super Q-650M层析和SP层析。

7.根据权利要求4所述的膜联蛋白V变体作为细胞凋亡探针的制备方法，其特征在于：进行荧光化学标记或者核素标记。

8.根据权利要求7所述的膜联蛋白V变体作为细胞凋亡探针的应用，其特征在于：在制备细胞凋亡监测试剂、疾病监测药物中的应用。