[发明专利]一种基于EGFP的T载体的制备方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种T载体及其制备方法。

背景技术

PCR是分子生物学和基因工程领域中最基本的技术之一，它是在体外获得大量目的基因或DNA片段的有效手段。PCR过程是由具有热稳定性的DNA聚合酶介导催化。当使用高保真DNA聚合酶扩增时，可得到具有平末端的PCR产物，而使用普通的TaqDNA聚合酶扩增时，可得到3’末端都具有单个凸起的A的PCR产物。这是因为普通的TaqDNA聚合酶除了正常的合成功能之外，还具有不依赖于DNA模板的合成能力，能够在PCR产物的3’末端额外地添加一个脱氧核苷酸，通常为dATP，使PCR产物并不是具有平末端的双链DNA，而是两个3’末端都多了一个A的双链DNA。正是这类PCR产物所具有的凸起的A，为PCR产物的直接克隆提供了便利，即可使用T-A克隆的方法，对PCR产物不作限制性内切酶处理的情况下，就可以在DNA连接酶的作用下，直接将PCR产物连接到T载体上。

在进行T-A克隆时，比较关键的是制备T载体，即在两个3’末端都具有一个凸起的T的线性化载体。T载体是处理构建好的前T载体而得到的，通常有两种策略：一种是利用能产生平末端的限制性内切酶（如EcoR V、Sma I）切割前T载体，得到具有平末端的线性化载体，然后在普通TaqDNA聚合酶的催化下，将dTTP添加到线性化载体的3’末端；另一种是利用特殊的限制性内切酶（如Xcm I、Eam1105 I）切割前T载体，直接产生两个3’末端都具有一个凸起的T的线性化载体。与第一种方法相比，使用第二种方法制备T载体时更加简便。

在构建前T载体时，不同的开发者往往使用不同的筛选标记基因，已商品化的T载体上的筛选标记基因主要是b-半乳糖苷酶a肽段基因（lacZ’）、细胞死亡控制基因（ccdB）等。使用lacZ’基因作为筛选标记基因时，可以根据a-互补原理，利用蓝白斑实现阳性克隆的筛选，但需要使用lacZ’缺陷型大肠杆菌菌株，还需要使用价格昂贵的X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基硫代半乳糖苷），另外，这两种试剂的失效或在平板上涂布不匀，都可能导致显色失败，产生假阳性结果。使用ccdB基因作为筛选标记基因时，由于ccdB产物的毒性，不产生载体自连的菌落，极大地提高了T-A克隆的效率，但在构建前T载体时需要使用特殊的菌株。

增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）也可作为筛选标记基因，借助紫外线的激发甚至日光的照射，可以观察到绿色荧光，因此，可以直接根据绿色荧光的有无，简便地筛选到阳性克隆。但是，由于EGFP基因连接在诱导型强启动子（如lac启动子、T7启动子等）下游，在实现阳性克隆的筛选时，还需使用IPTG作为诱导剂，且绿色荧光不够强，需在紫外灯下进行筛选，而紫外线的照射可能对菌落或目的基因造成损伤，或者在37℃下进行长时间的培养，通常为16-18小时，在这样的条件下很容易产生卫星菌落。这两个因素限制了EGFP基因在T-A克隆中的应用。因此，要有效地利用EGFP基因作为筛选标记，最关键的是在EGFP基因上游采用组成型强启动子，无需紫外线照射或长时间培养，在日光或日光灯照射下，就能够看到菌落是否具有明显的绿色荧光。大肠杆菌lpp基因启动子是一个组成型强启动子，?krlj等人报道了突变的脂蛋白（lpp）基因的启动子（Pm），它具有更强转录活性。本发明将该突变启动子构建到EGFP基因上游，成功构建了以EGFP基因作为筛选标记的T载体，应用该T载体进行T-A克隆时，载体自连产生的假阳性菌落在37℃培养12小时后，在日光照射下即可呈现明显的绿色荧光，极大地提高了T-A克隆的效率。

 

发明内容

本发明为了克服上述现有技术中的不足，提供一种制备T载体的方法，以提高T-A克隆的效率。

本发明以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为筛选标记，用组成型强启动子Pm介导EGFP基因的表达，并将能切割前T载体制备T载体的限制性内切酶（EcoR V、Xcm I等）识别位点引入EGFP基因上游。

1、一种基于增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的T载体，所述T载体的两个末端位于组成型启动子和EGFP基因之间，所述T载体应用于T-A克隆时，载体自连产生的假阳性菌落在日光下呈现绿色荧光，携有外源DNA的阳性菌落呈现白色；