[发明专利]弓形虫重组卡介苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种弓形虫重组卡介苗，用于预防治疗弓形虫病，本发明还提供了该疫苗的制备方法，属于疫苗制备技术领域。

背景技术

弓形虫病（Toxoplamasis）是由刚地弓形虫引起的一种世界范围内广泛分布的人兽共患病，由于其宿主范围非常广，能够感染人及大多数动物。弓形虫感染对畜牧业生产危害严重，主要造成流产、畸胎、死产等。弓形虫的危害巨大，但对该病的防治至今尚未找到理想的药物。尽管抗寄生虫药物非常有效、廉价并且易于用药，但弓形虫耐药性的产生以及人们普遍关注的药物残留问题日益严重。相比而言，疫苗比较安全，无化学残留且无污染。有学者通过对弓形虫抗原及免疫效应的深入研究后认为有效的疫苗对该病的防治具有显著的意义。弓形虫疫苗的研究经历了灭活疫苗、减毒活疫苗等多种探索，前者刺激机体产生的抗感染能力弱，后者虽能较好地产生保护作用，但由于经突变后恢复毒力，故不适用于人类，因此，采用基因工程方法发展一种高效，廉价的新型弓形虫疫苗是本发明的任务。

发明内容

本发明提供一种弓形虫重组卡介苗，为穿梭表达载体弓形虫重组卡介苗和整合表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗，具有热稳定性好，运输和保存较为容易，易于生产，产品不需纯化等特点。

本发明还公开了弓形虫重组卡介苗的制备方法，适用于工业化生产。

本发明弓形虫重组卡介苗的解决方案如下：首先将获得刚地弓形虫保护性抗原基因，进行TA克隆，测序鉴定正确后酶切回收目的片段，再分别与同样进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361相连，重组质粒转化到BCG，经抗性和PCR筛选得到阳性刚地弓形虫重组卡介苗。

本发明所提供的弓形虫重组卡介苗疫苗的制备方法

本发明以刚地弓形虫保护性抗原Cyclophilin（CyP）基因为例，进行穿梭表达载体和整合表达载体的构建，分别制成疫苗。

、穿梭表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗的制备：

根据刚地弓形虫CyP基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆。测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同样酶切的pMV261穿梭表达载体进行连接，转入DH5α中，将重组质粒CyP-261电穿孔转化卡介苗中，37℃培养至对数生长期后，筛选BCG重组子，PCR证实为阳性克隆后进行45℃热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blotting 鉴定，命名为rBCG pMV261-CyP。

检测疫苗：将制备好的穿梭表达载体刚地弓形虫重组卡介苗疫苗rBCG pMV261-CyP以100ug/只的剂量通过口服、静脉注射两种不同免疫途径免疫BALB/c雌性小鼠，并同时设BCG组和空白对照组，三免一周后腹腔注射的方式接种弓形虫RH株速殖子进行攻虫试验，通过存活时间、存活率、脑组织包囊数、体液免疫水平和细胞免疫水平检测等指标进行综合评价。

穿梭表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗rBCG pMV261-CyP可对抗中等剂量刚地弓形虫的攻击，静脉注射试验组与对照组相比，特异性抗体滴度随免疫次数增加而逐渐升高，且差异极显著（P<0.01）；CD4+ 与CD8+T淋巴细胞数均明显升高，且与对照组相比差异极显著（P<0.01）；CD4+/CD8+比值，各组差异不显著（P>0.05）。经腹腔接种弓形虫1000个/只，结果为静脉注射试验组较对照组脑组织包囊数减少可达45%，小鼠存活时间与对照组相比差异显著（P<0.05）。口服试验组与对照组相比，特异性抗体滴度随免疫次数增加而逐渐升高，且差异显著（P<0.05）；CD4+ 与CD8+T淋巴细胞数均明显升高，且与对照组相比差异显著（P<0.05）；CD4+/CD8+比值，各组差异不显著（P>0.05）。经腹腔接种弓形虫1000个/只，结果为口服试验组较对照组脑组织包囊数减少可达41.2%，小鼠存活时间与对照组相比均差异显著（P<0.05）。提示我们单独使用BCG对增强刚地弓形虫免疫保护力也有一定的效果，其中以静脉注射方式免疫效果更好。

、整合表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗的制备：