[发明专利]弓形虫重组卡介苗及制备方法

权利要求书

1. 一种弓形虫重组卡介苗，其特征在于：首先获得刚地弓形虫保护性抗原基因，进行TA克隆，测序鉴定正确后酶切回收目的片段，再分别与同样进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361相连，重组质粒转化到BCG，经抗性和PCR筛选得到阳性刚地弓形虫重组卡介苗。

2. 一种穿梭表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗是通过以下步骤制备的：

根据刚地弓形虫CyP基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆；测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同样酶切的pMV261穿梭表达载体进行连接，转入DH5α中，将重组质粒CyP-261电穿孔转化卡介苗中，37℃培养至对数生长期后，筛选BCG重组子，PCR证实为阳性克隆后进行45℃热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blotting 鉴定。

3. 根据权利要求2所述重组卡介苗疫苗的制备工艺，包括以下步骤：

1）参照Cyclophilin基因DNA序列及穿梭载体pMV261物理图谱设计两对引物并引入酶切位点：

上游引物QF1：5’- GAATTCATGAAGCTCGTGCTGTTTTTCCT -3’；其中5`端含有EcoRI位点；

下游引物QR：5’- GTCGACTTACTCCAACAAACCAATGTCCGT -3’； 其中5`端含有SalI位点；

2）将PCR纯化产物克隆至pMD18-T载体并进行PCR、酶切及测序鉴定，凝胶回收片段与同样进行酶切的穿梭表达载体pMV261连接，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞后筛选重组质粒，用EcoRI、SalI进行双酶切反应，得pMV261-CyP重组质粒；

3）将BCG接种于MB7H9 ADC液体培养基中，37℃培养至对数生长期，离心收集菌体，沉淀用10%甘油洗涤，最后重悬1ml 10%甘油中，用于电转化；

4）取60-80ulBCG感受态菌液加入0.1ug重组质粒PMV261-CyP置于电转杯中；电穿参数：电压2.5KV,电容25μF，电阻1000Ω；电穿孔转化后立即加入MB7H9 ADC培养基中，37℃培养2d后涂布于含20ug/mlKan MB7H9 ADC培养基平板，约3w后长出转化菌落；

5）从培养基平板上挑取BCG重组子，接种于液体培养基（含Kan）,37℃培养至对数生长期，PCR证实阳性克隆后，45℃水浴中诱导4h，离心收集菌体，并处理，最后加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃5min；取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Western blotting 鉴定

6）将构建成功的含有CyP基因的rBCG pMV261-CyP接种于MB液体培养基中，37℃培养至对数生长期(3-4周)，离心收集菌体，沉淀用生理盐水洗涤2次，最后重悬于灭菌生理盐水中。

4.一种整合表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗是通过以下步骤制备的：

根据刚地弓形虫CyP基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆；测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同样酶切的pMV361穿梭表达载体进行连接，转入DH5α中，将重组质粒CyP-361电穿孔转化卡介苗中，37℃培养至对数生长期后，筛选BCG重组子，PCR证实为阳性克隆后进行45℃热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blotting 鉴定。

5.根据权利要求4所述重组卡介苗疫苗的制备工艺，包括以下步骤：

1）参照Cyclophilin基因DNA序列及穿梭载体pMV361物理图谱设计两对引物并引入酶切位点：

上游引物QF2:  5’- CTCGAGATGAAGCTCGTGCTGTTTTTCCT -3’；其中5`端含有XhoI位点；

下游引物QR：5’- ATCGATTTACTCCAACAAACCAATGTCCGT -3’； 其中5`端含有ClaI位点；

2）将PCR纯化产物克隆至PMD18-T载体并进行PCR、酶切及测序鉴定，凝胶回收片断与整合表达载体pMV361连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后筛选重组质粒，用XhoI、ClaⅠ进行双酶切反应，得PMV361-CyP重组质粒；

3）60-80ul感受态BCG菌液加入0.1ug重组质粒PMV361-CyP置于电转杯中；电穿参数：电压2.5KV,电容25μF，电阻1000Ω；

4）电穿孔转化后立即加入MB7H9 ADC培养基中，37℃培养2d后涂布于MB7H9 ADC培养基平板；

5）从培养基平板上挑取BCG重组子，接种于液体培养基，37℃培养至对数生长期，PCR证实阳性克隆后45℃水浴中诱导4h，离心收集菌体，并处理，最后加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃5min；取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Western blotting 鉴定；

6）将构建成功的含有CyP基因的rBCG pMV361-CyP接种于MB液体培养基中，37℃培养至对数生长期(3-4周)，离心收集菌体，沉淀用生理盐水洗涤2次，最后重悬于灭菌生理盐水中。