[发明专利]一种核酸的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸的检测技术，特别涉及一种是以荧光探针为基础的核酸的检测方法。

背景技术

目前，国内外进行基因分型检测的方法越来越多，常见的有核苷酸序列分析，限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)，型特异引物法和型特异探针杂交。测序法虽然最为准确，但技术条件要求高、费用昂贵。RFLP敏感性高，但酶切位点易受基因变异影响，且遇混合感染或酶切不完全，会出现复杂条带，影响型结果判断。型特异引物聚合酶链式反应(SSP-PCR)则需要进行多管反应，操作不便而且费用也相对较高。型特异探针杂交法应用越来越广泛，例如基于此技术发展起来的胶体金技术、基因芯片技术、斑点杂交等，这些技术已应用于基因表达分析、基因分型以及临床研究等领域。此类技术是基于互补的双链脱氧核糖核酸(DNA)链能够在一定条件下特异性的结合，即严格按照碱基互补的原则进行，因此，当用一段特定的核酸序列作为探针，与靶核酸混合后，如果两者的碱基能够匹配，它们即互补地结合成双链，从而指示被测核酸模板中含有特定的基因序列。

胶体金免疫层析技术具有简便直观和快速的特点，在早孕检测应用中取得了极大的成功，随后在各个领域迅速被扩大应用。2009年，Liu等(1、X.Mao，Y.Q.Ma，A.G.Zhang，L.R.Zhang，L.W.Zeng and GD.Liu，Disposable Nucleic Acid Biosensors Based on Gold Nanoparticle Probes and Lateral Flow Strip，Anal.Chem.，2009，81(4)，1660-1668)制备的核酸层析金标试纸条，使用胶体金标记核酸探针，可直接检测核酸DNA，检测人基因组DNA的检出限达0.5nM，适应于现场检测。公开号CN1811447A的中国专利公开了一种特异性核酸序列扩增物的单探针及双探针检测方法，此发明使用通用的两种抗体，用标准试纸条检测任何来源的核酸序列扩增物。这些报道或专利所检测的方法可以实现快速定性的检测，但是探针标记过程复杂，信号检测依赖呈色反应而灵敏度低，而且只有单种颜色而使得检测靶序列数目有限。

基因芯片技术是近年来分子生物学及医学研究领域的重要进展，可一次性对大量样品基因序列进行检测和分析，具有高通量和自动化等特点，解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低的缺点。公开号CN101792819A的中国专利公开了一种高通量可目视化人乳头瘤病毒基因芯片快速分型检测方法，该方法也使用胶体金标记核酸探针，通过银染来提高金信号，通过目视直接进行信号的判断，解决了目前检测结果不能通过肉眼直接看到的缺点。公开号CN1354258的中国专利公开了一种生物大分子快速检测的层析生物芯片技术，主要是根据DNA、信使核糖核酸(mRNA)和蛋白抗体溶液层析过程中被固定的DNA和蛋白探针捕获的原理设计，用流动相带动样品沿膜载体层析，靶物质会被相应的固定探针阵列俘获，达到快速分离鉴定的目的。但上述基因芯片方法存在检测针对性不强，尤其是成本高，依赖于大型仪器等问题，不利于临床上的广泛应用，更重要的是，目前大量研究发现在某一疾病发生发展过程中仅有小部分基因(几十到几百个)表达谱发生变化，而高密度基因芯片所选基因固定，缺乏个性化，在疾病研究中应用势必造成资源浪费。

另外，公开号为CN101748204A的中国专利公开了一种基于微流控的核酸杂交平台及杂交分析方法，该杂交分析方法以离心力和毛细管作用力作为驱动力促使液流在杂交通道中自动地往复流动，样品液流在毛细管作用力下由临时集液池返回杂交通道，这样重复的旋转和停止芯片就可以实现液流的往复。此发明具有物质传质快，杂交时间短，样品消耗少，并且可以同时对多个样品进行平行分析等优点。公开号为CN101886141A的中国专利公开一种鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒，是用特定引物通过PCR，再通过交叉斑点分子杂交，以特异性核酸探针检测样品中致病性外源性禽白血病毒特异性核酸的存在。利用该发明所涉及的试剂盒，对从组织样品中提取的基因组DNA作交叉斑点分子杂交或对提取的DNA用相应引物扩增后的PCR产物作交叉斑点分子杂交，可在24～36h内完成检测并报告结果。此类方法的检测时间较长，需要的样品较多，要实现大规模的临床应用较困难。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种适用范围广、灵敏度高、精确度高、成本低、简便快速的核酸的检测方法。

本发明的第二目的在于提供一种核酸膜层析杂交试纸条。

本发明的第三目的在于提供一种人乳头瘤病毒的检测方法。