[发明专利]一种检测手足口病病原的纳米探针芯片及其应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病原检测纳米探针芯片，特别是涉及特异检测手足口病病原的纳米探针芯片技术及其应用。

背景技术

手足口病(hand-foot mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的传染病，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)最为常见，而且发病死亡的患儿中主要是因为感染了EV71病毒。EV71是小RNA病毒科，肠道病毒属成员。病毒基因组为7408个核苷酸(SHZH98)的单股正链RNA。近年来，EV71引起的手足口病重症和死亡病例增长迅速。截至5月4日，全国已累计报告手足口病病例427278例，同比上升超40％，其中死亡260例，同比上升142.99％。国内目前95％以上的手足口患儿都是由EV71病毒引起的，表现为危重型症状，重症患儿的病死率更是高达5％。HFMD至今仍无有效的疫苗和特异性治疗手段，所以，对EV进行快速检测无论是对于指导治疗还是控制HFMD疫情都具有重要价值。

目前，EV的检测方法包括病毒分离培养、病毒核酸检测和血清学检查三个方面。病毒分离方法费时、费力，检测种类少，无法满足疾病流行期间同时处理大量样本的需要。病毒核酸检测是采用逆转录聚合酶链反应(PCR，RT-PCR)技术，为当前肠道病毒快速检测的主要手段，该方法灵敏度高，但具有样品污染，假阳性率高等缺点，同时，普通PCR和荧光定量PCR由于各组引物间不兼容性、扩增背景高以及重复性差等因素不利于多重检测。血清学检查同样由于检测通量局限性而不能满足检测需求。传统固相芯片价格昂贵，敏感性不高，检测结果可重复性差。液相芯片技术能够实现高通量检测，但由于需要PCR扩增存在操作复杂、易污染等缺点。基因芯片技术具有高特异性、高灵敏度、高通量的特点，为临床和环境检测提供了良好的应用前景。目前通用的基因芯片技术有多种，但分别都存在着灵敏度不高，或者检测技术复杂，或者条件和设备要求高的问题限制了该技术在临床检测中的应用。当前基于纳米金探针技术已被报道应用于肝炎病毒和人乳头瘤病毒检测中，该技术通过金标银染法达到相对定量检测靶DNA的目的，而其纳米探针荧光强度针对不同浓度待测抗原响应值区分差异较小，从而限制了其检测灵敏度。

发明内容

本发明针对以上现有技术存在的缺点，提出一种快速检测手足口病病原的纳米探针芯片及其制备方法，并通过对其的应用达到检测种类多、反应时间短、灵敏度高且特异性强的效果。

本发明的原理是：结合纳米探针芯片技术，将带有氨基或者经过氨基修饰的针对病原特征信息的特异性检测分子，化学偶联到纳米荧光探针，制成纳米探针芯片。再将通过能量共振转移特异淬灭纳米荧光探针的信号探针与待测病原分子交联反应，将信号探针-待测病原复合物与纳米探针芯片混合反应后，通过荧光图谱扫描，根据信号探针对纳米探针荧光强度的淬灭程度，以标准品多肽抗原为阳性对照，判定待测物中病原的浓度。从而达到快速准确检测病原的目的。其中病原特征信息指病原抗原或者病原核苷酸序列。本发明采用了特有的基于能量共振转移技术的信号放大机制，从而克服了现有纳米探针检测技术的灵敏度局限性。

本发明的发明目的通过以下技术方案实现：

一种检测手足口病病原的纳米探针芯片，主要由分别包被有病原特异性检测分子的纳米荧光探针构成，所述纳米荧光探针包括以下纳米探针中一种或者几种：

不同荧光发射波长的水溶性量子点，

硅壳纳米荧光探针、

壳聚糖纳米荧光探针；

磁性纳米荧光探针；

所述特异性检测分子为以下分子中的至少一种：

EV71抗体或EV71抗原适配子序列；

EV抗体或EV抗原适配子序列；

CAV16抗体或CAV16抗原适配子序列；

针对EV 5’端非编码区、EV71 VP1区、CAV16 VP1区核酸序列各区段基因中的DNA分子探针。

所述纳米荧光探针的荧光发射波长范围为300-1000nm。

所述EV71抗体的适配子序列为以下5’端经氨基修饰后适配子序列中的至少一种：