[发明专利]霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针及检测方法

权利要求书

1.霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针，分别是：

①沙门氏菌的fimY基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-CCGTATGGCTGGGCGTTT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG-3′，

探针(SEQ ID NO.3)：5′FAM-CAGAGGCCAGATTTT-3′；

②霍乱弧菌的hlyA基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.4)：5′--GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT--3′，

反向引物(SEQ ID NO.5)：5′-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3′，

探针(SEQ ID NO.6)：5′NED-CCAAGCTCAAAACCTG-3′；

③副溶血性弧菌的toxR基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5′-CAAACATCAAACTGTTCGCACAA-3′，

反向引物(SEQ ID NO.8)：5′-CCAGCGACCTTTCTCTGAAATATT-3′，

探针(SEQ ID NO.9)：5′VIC-CTCGACGGCTGAATC-3′。

2.霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR检测方法，包括如下步骤：

①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；

②反应体系：总体积20ul，包括步骤①制得的模板DNA溶液1μl，2×PCRTaqman GEx酶预混液10μl，沙门氏菌上下游引物各0.8μL、探针0.3μL，霍乱弧菌上下游引物各0.4μL、探针0.2μL，副溶血性弧菌上下游引物各0.4μL、探针0.2μL、灭菌超纯水5.1μl；其中各引物和探针的浓度均为10μM；

以上各组分加入至0.2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：

95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。