[发明专利]霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品中病原微生物的检测方法，尤其涉及利用实时荧光PCR技术检测样品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的方法。还涉及检测所使用的特异性引物和探针序列。

背景技术

快速、准确的检测食品中的致病菌是有效预防和控制病原菌感染的重要条件。现有的检测方法中，对霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的检测仍采用常规的微生物检测方法，这些方法费时费力，无法满足快速高通量检测的要求，检测时还会出现假阳性，影响结果分析，可能会带来较大的经济损失。并且，食品检测中常常是一份样品同时检测几种致病性微生物。因此，有必要研究一种方法，可同时针对多个致病菌、快速且大批量进行检测。在PCR反应中使用一对以上的引物和不同荧光标记物的探针进行检测的多重实时PCR技术在同一样品的多种致病菌检测中已经有一定的应用，但现有技术中还未见有针对霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌检测的多重PCR技术。本发明人即旨在建立利用多重实时PCR技术快速、准确、灵敏检测多种致病菌的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供食品样品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR检测方法，以及检测中所使用的包含特异性引物及探针序列。

为实现上述目的，本发明首先提供食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针，它们分别是：

①沙门氏菌的fimY基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-CCGTATGGCTGGGCGTTT-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG-3′，

探针(SEQ ID NO.3)：5′FAM-CAGAGGCCAGATTTT-3′；

②霍乱弧菌的hlyA基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.4)：5′--GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT--3′，

反向引物(SEQ ID NO.5)：5′-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3′，

探针(SEQ ID NO.6)：5′NED-CCAAGCTCAAAACCTG-3′；

③副溶血性弧菌的toxR基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5′-CAAACATCAAACTGTTCGCACAA-3′，

反向引物(SEQ ID NO.8)：5′-CCAGCGACCTTTCTCTGAAATATT-3′，

探针(SEQ ID NO.9)：5′VIC-CTCGACGGCTGAATC-3′。

本发明进一步提供了利用上述引物和探针的食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR检测方法，包括如下步骤：

①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；

②反应体系：总体积20ul，包括步骤①制得的模板DNA溶液1μl，2×PCRTaqman GEx酶预混液10μl，沙门氏菌上下游引物各0.8μL、探针0.3μL，霍乱弧菌上下游引物各0.4μL、探针0.2μL，副溶血性弧菌上下游引物各0.4μL、探针0.2μL、灭菌超纯水5.1μl；其中各引物和探针的浓度均为10μM；

以上各组分加入至0.2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：

95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。

本发明中所应用的具体的判断标准是：

Ct值≥40，可判断样品结果为阴性，可直接报告未检出相应致病菌；

Ct值≤35.0，可判断该样品结果为阳性；

Ct值＞35.0而＜40，建议重做样本。重做结果Ct值≥40者为阴性，否则为阳性。

与经典方法的细菌分离、鉴定和血清学分型试验方法相比，本发明的方法更快速、准确。且较一般的多重PCR方法特异性强，灵敏度高，能够同时对以上述三种病原菌进行检测和鉴定。对此三种菌的检测特异性均为100％，检测灵敏度分别为沙门氏菌：13CFU/ml、霍乱弧菌17CFU/ml和副溶血性弧菌23CFU/ml。

具体实施方式

下面为本发明的具体实施例，它对本发明技术方案的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。