[发明专利]一种柯萨奇病毒A16_3C蛋白酶的结构及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种3C蛋白酶的结构及其应用，尤其是一种具有独特底物结合槽的柯萨奇病毒A16 (CVA16) 3C蛋白酶。

背景技术

柯萨奇病毒A16 (CVA16)是最常见的引起小儿手足口病的致病原之一。手足口病近些年在世界范围内，尤其是东亚地区(中国大陆，台湾，日本等)的爆发流行，导致了巨大的生命财产和经济损失。目前尚没有行之有效的预防和治疗手段。

CVA16编码一个病毒特异的蛋白酶叫3C蛋白酶。该蛋白酶可以将病毒编码的多聚蛋白前体加工成功能性的蛋白亚基，因而在病毒的复制和生命周期中发挥着重要作用。而在人类中缺少该蛋白酶的同源蛋白，因此能抑制该蛋白酶活性的化合物能有效抑制病毒的复制，进而成为治疗手足口病的方法之一。目前，特异性针对CVA16病毒3C蛋白酶的抑制剂分子仍然匮乏。

利用高分辨率的病毒3C蛋白酶的晶体结构，寻找可与之特异性结合的小分子，或者对已知化合物进行以结构为基础的改造进而获得活性更高的化合物，已成为药物筛选的有效手段。目前还没有CVA16病毒3C蛋白酶的晶体结构。

在目前已报道的有晶体结构的3C蛋白酶中，与CVA16病毒3C蛋白酶序列上相似性最高的是鼻病毒(HRV)和柯萨奇病毒B3(CVB3)的3C蛋白酶，彼此间的序列相似度也只有50%左右。与之相应，虽然这三种病毒均属于小RNA病毒科肠病毒属，但HRV属于人类鼻病毒种，CVB3属于人类肠病毒B种，而CVA16归于人类肠病毒A种。因此以HRV或CVB3病毒的3C蛋白酶结构为基础模建的CVA16-3C蛋白酶结构与真实结构间可能存在较大的差异，也使得筛选特异性针对CVA16病毒3C蛋白酶的抑制剂分子难以实现。

因此获得大量有活性、高纯度的CVA16-3C蛋白酶，进而解析其晶体结构，从而为后续的抑制剂筛选提供结构依托，是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种柯萨奇病毒A16 (CVA16) 3C蛋白酶的结构。

所述3C蛋白酶为如（a）或（b）或（c）的蛋白质：

（a）有SEQ ID NO.1所示的氨基酸组成的蛋白质，

（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有3C蛋白酶活性的由（a）衍生的蛋白质，

（c）与（a）中氨基酸序列整体相似度在85%以上，并且在R39，K130，H24，Q19，E107和H108等六个位置上氨基酸完全保守的由（a）衍生的蛋白质。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种所述3C蛋白酶结构在药物设计中的应用，尤其是在药物分子设计中的应用。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种所述蛋白酶的底物结合槽。

所述底物结合槽氨基酸组成及空间排布如SEQ ID NO.2和图5D所示，其S2位点为半封闭的槽状结构，S1’位点的容积显著变小。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种所述底物结合槽在药物设计中的应用，尤其是在药物分子设计中的应用。

本发明首次获得了柯萨奇病毒A16 (CVA16) 3C蛋白酶的晶体结构，在晶体结构的基础上，发现了其底物结合槽的特殊性，为以此结合槽为靶点的小分子抑制剂设计提供了结构基础。

附图说明

图1 CVA16 3C蛋白酶的分子筛图谱

黑线为280nm吸收值，红线为260nm吸收值，两者的比值在1.5左右，表明目的蛋白中没有核酸类污染，图中出峰处各收集样品4-16号进一步以SDS-PAGE分析。

图2 CVA16 3C蛋白酶SDS-PAGE图谱

各泳道对应分子筛图谱中的4-16号收集样品，M表示低分子量蛋白Marker。

图3 CVA16 3C蛋白酶的体外活性检测

A: 底物, B: 底物+CVA16-3C-C147A, C: 底物+CVA16-3C。

图4 CVA16-3C蛋白酶的晶体结构。

图5 CVA16-3C蛋白酶的底物结合槽。

A: 底物多肽(序列：FAGLRQAVTQ)+ CVA16-3C的复合物结构  B: AG7088+CVA16-3C的复合物结构 C:底物结合槽  D: 底物结合槽空间结构。

图6 AG7088结构式

A-E分别代表P1’，P1，P2，P3，P4各基团。

图7 CVA16-3C蛋白酶和HRV-3C蛋白酶S2位点比较

A: CVA16-3C的S2位点，B: HRV-3C的S2位点。