[发明专利]高通量检测血清样本中十二种病原抗体的液相芯片及其制备方法和使用方法

权利要求书

1.一种高通量检测血清样本中十二种病原抗体的液相芯片，其特征在于，该液相芯片包括：包被有捕获抗原的十二种编码微球、生物素标记的二抗作为捕获抗体、链亲和素-藻红蛋白及相关缓冲溶液，其中，作为捕获抗原的有东部马脑炎病毒E1C蛋白抗原、西尼罗E蛋白抗原、黄热E蛋白抗原、土拉fopA蛋白抗原、登革热E2蛋白抗原、禽流感H5蛋白抗原、普氏立克次体120C蛋白抗原、蜱传脑炎病毒E-D3蛋白抗原、Q热立克次体coml蛋白抗原、委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白抗原、马秋波GP2蛋白抗原、西部马脑炎病毒E1C蛋白抗原。

2. 如权利要求1所述的高通量检测血清样本中十二种病原抗体的液相芯片，其特征在于，所述编码微球优选011、025、027、028、031、032、033、034、043、044、061和071号编码微球，其中，

011编码微球用东部马脑炎病毒E1C蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

025编码微球用西尼罗E蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

027号编码微球用黄热E蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

028号编码微球用土拉fopA蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

031号编码微球用登革热E2蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

032号编码微球用禽流感H5蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

033号编码微球用普氏立克次体120C蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

034号编码微球用蜱传脑炎病毒E-D3蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

043号编码微球用Q热立克次体coml蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

044号编码微球用委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

061号编码微球用马秋波GP2蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

071号编码微球用西部马脑炎病毒 E1C蛋白抗原作为捕获抗原来包被。

3. 一种检测上述十二种病原抗体的液相芯片的制备方法，其特征在于，该方法具体为：在相关缓冲溶液中，用不同的十二种抗原分别包被十二种编码微球，用生物素标记的二抗为羊抗人IgG或/和Biotin-SPA，用链亲和素-藻红蛋白SA-PE作为信号检测物。

4. 一种利用上述液相芯片高通量检测血清样品中抗体的间接免疫学定量检测方法，其特征在于，该方法具体为：

1）在相关缓冲溶液中，将十二种蛋白抗原作为捕获抗原来包被编码微球；

2）向检测载体内加入含十二种已包被捕获抗原编码微球的工作溶液、或单一包被捕获抗原编码微球的工作溶液、或几种已包被捕获抗原编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；

3）加入待测血清样品，孵育后清洗；

4）加入用生物素化的二抗，孵育后清洗；

5）加入链亲和素-藻红蛋白，孵育后清洗；

6）加入检测缓冲液后混合均匀；

7）用液相芯片系统读取平均荧光强度MFI数值，并分析数据判定检测结果，以完成血清样品中十二种抗体的同时检测、或单一抗体的检测、或同时完成几种抗体的检测。

5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述检测过程中所有反应可在96孔滤板上或在微量离心管中进行。

6.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1）中采用生物素标记的SPA作为捕获抗体，并且其与各包被编码微球的捕获抗原组合组成间接法检测体系。

7.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述相关缓冲溶液包括用于所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素标记的二抗所用的抗体稀释液、每个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、SA-PE稀释液、检测缓冲液。

8.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述生物素标记的二抗优选为Biotin-羊抗人和/或Biotin-SPA。

9.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，包被各种所述编码微球的各捕获抗原用量为0.01～300μg /1.25×10⁶个编码微球，标记检测抗体SPA的所述生物素为羧基活性的生物素，2mg/mL生物素化的检测二抗Bioin-SPA以1：2500稀释作为检测物进行检测。

10.一种采用上述液相芯片定量检测血清样品中土拉抗体、登革热抗体的方法，其特征在于，该方法具体为：

1）加入的阳性检测样品或标准品经4倍梯度倍比系列稀释；

2）将系列稀释样品在液相芯片系统中检测读取对应荧光值MFI；

3）制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应标准曲线；

4）用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程；

5）根据剂量-反应曲线可判定方法的动态检测范围，未知浓度样品可根据剂量-反应方程判断检测样品的浓度。