[发明专利]鲍肌肉萎缩症病毒的快速诊断试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及水生经济动物病害的诊断试剂盒及检测方法，尤其是涉及鲍肌肉萎缩症病毒的快速诊断试剂盒及检测方法。

背景技术

鲍是中国传统的名贵食材，其肉质鲜美、营养丰富，是世界各地广泛的养殖的海产经济贝类。2005年冬天，福建、广东等地鲍养殖场普遍爆发大规模病害，症状主要表现为肌肉和外套膜萎缩，体色发黑，各阶段鲍均可发病，对我国南方鲍养殖业造成毁灭性打击。后经鉴定该病病原为肌肉萎缩症病毒(Abalone Shriveling syndrome associated Virus，AbSV)。到目前为止，对于病毒病还没有有效的治疗方法，防止病毒的传染和流行是能够采取的主要措施，早期快速诊断该病毒是减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好、灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法对于疾病的预防意义重大。

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是目前流行的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，广泛应用于实践中。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种鲍肌肉萎缩症病毒的快速诊断试剂盒。

本发明的第二个目的是提供一种应用上述鲍肌肉萎缩症病毒的快速诊断试剂盒进行鲍肌肉萎缩症病毒的检测方法。

本发明的第一个目是通过以下技术方案来实现的：鲍肌肉萎缩症病毒的快速诊断试剂盒，其包括以下部件：

(1)DNA提取液；

(2)消化液；

(3)G1液：用于PCR一扩反应，包括含Mg2+的Buffer、dNTP、正向引物F1、反向引物R1和Taq酶；

F1为：5-ATGACAGATTTCACCGTAAGCAATGAAAATC-3，

R1为：5-CTAGCTGGCTTTGGTATAAGTAGTACCAAAAG-3；

(4)阳性对照H液：100ng/μL肌肉萎缩症病毒感染的鲍基因组DNA。

若使用PCR一扩反应液检测的结果为阴性，需要做进一步的检测，因而本发明中所述试剂盒还包括以下部件：

(5)G2液：用于PCR二扩反应，包括含mg²⁺的Buffer、dNTP、正向引物F2、反向引物R2和Taq酶；

F2为：5-GCAACATTCCAGTTAGCC-3，

R2为：5-CCGTAGTAGCAGGAGCAA-3；

本发明所述PCR一扩反应液G1液中，含3mmol/L Mg²⁺、100mmol/L KCl、400μmol/LdNTPs、2μmol/L正向引物F1、2μmol/L反向引物R1、4U的Taq酶。

本发明所述PCR二扩反应液G2液中，含3mmol/L Mg²⁺、100mmol/L KCl、400μmol/LdNTPs、2μmol/L正向引物F2、2μmol/L反向引物R2、4U的Taq酶。

本发明所述的DNA提取液部件包括以下六种分别独立盛装在试剂容器中的溶液：

①A液：10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA和0.1％(m/V)SDS的混合溶液；

②B液：12mL的5mol/L醋酸钾，2.3mL冰醋酸和5.7mL水的混合溶液；

③C液：异丙醇；

④D液：70％乙醇；

⑤E液：10mmol/L Tris-cl(pH8.0)和1mmol/L EDTA的混合溶液。

本发明所述的消化液包括以下两种分别独立盛装在试剂容器中的溶液：

⑥F1液：20mg/mL蛋白酶K；

⑦F2液：4mg/mL RNase A。

本发明所述的肌肉萎缩症病毒感染的鲍基因组DNA可采用常规方法进行制备，还可以采用以下方法制备：

1)取肌肉萎缩症病毒感染的杂色鲍外套膜或肌肉组织样本10-20mg加入400-800μLA液进行稀释，于匀浆器中冰浴匀浆得匀浆液；

2)在步骤1)的匀浆液中加入2-4μL F1液，50-60℃放置消化2-4个小时；

3)待步骤2)中的经F1液消化处理的匀浆液降至室温，加入2-4μL F2液，在37℃放置消化2-4个小时得到消化溶液；