[发明专利]在制备多肽的方法中有效的真菌转录激活因子

说明书

本申请是申请日为2001年03月14日，申请号为01808199.1(国际申请号为PCT/DK01/00169)，名称为“在制备多肽的方法中有效的真菌转录激活因子”的发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及分离的核酸序列，其编码具有转录激活活性的多肽，本发明还涉及所述的多肽。本发明还涉及包括所述核酸序列的核酸构建体、载体以及宿主细胞。本发明进一步涉及有效用于制备所述多肽的宿主细胞，在所述的宿主细胞中转录激活因子的产生或功能被改变，本发明还涉及用于制备所述多肽的方法。

背景技术

近年来，重组宿主细胞在异源蛋白表达中的应用大大简化了商品化蛋白的大量制备，否则只有通过从其天然来源中纯化才能获得所述的蛋白。目前，可以选择不同的表达系统，包括细菌和真核宿主，从所述的系统中选择用于制备任何特定蛋白。对适当表达系统的选择通常不仅有赖于宿主细胞在活跃状态产生足够产量蛋白的能力，而且在很大程度上也可能由所述蛋白预期的最终用途决定。

经常遇到的一个问题是由特定宿主细胞产生的或存在于培养基中的高水平的蛋白水解酶。一个建议是提供失去了产生特异性蛋白水解化合物能力的宿主生物体。例如，WO 90/00192(Genencor，Inc.)描述了不能分泌有酶活性的天冬氨酸蛋白酶的丝状真菌宿主。EP 574 347(Ciba Geigy AG)描述了枯草杆菌蛋白酶型的丝氨酸蛋白酶缺陷的曲霉宿主。WO 98/12300(Novo Nordisk A/S)描述了金属蛋白酶以及碱性蛋白酶缺陷的宿主。WO97/12045(Genencor，Inc.)描述了由于参与蛋白酶基因调节的启动子序列的破坏而导致造成蛋白酶缺陷的酵母和细菌宿主系统。

Mattern，I.E等，(1992.分子和普通遗传学(Mol Gen Genet)234：332-336)描述了黑曲霉的一个突变株，其被表明仅仅具有亲代菌株1％到2％的细胞外蛋白酶活性，这显然是由于至少两种蛋白酶曲霉胃蛋白酶A(aspergillopepsin A)和曲霉胃蛋白酶B(aspergillopepsin B)的缺陷。提示蛋白酶缺陷表型可能由影响编码两种蛋白酶基因表达的调控性突变造成。

真核转录在一个特定启动子或一组启动子处的起始需要一种真核转录激活因子，其为一种多肽，但其本身不是RNA聚合酶的一部分。许多转录激活因子结合至启动子上的特定位点形成起始该多肽编码序列的转录所需的一种功能性启动子。然而，只有在其他多肽存在下，转录激活因子也可以被并入一种转录起始复合物。对真菌中具有转录激活活性的多肽已经进行了描述，而且已公开了此类多肽的名单(Dhawale，S.S.，和Lane，A.C.1993.核酸研究(Nucleic Acid Research)21：5537-5546)。

本发明建议的解决方法：

本发明的一个目的是提供改进的方法用于在宿主细胞中增加多肽的产生，在所述的宿主细胞中参与调节蛋白酶产生的转录激活因子的活性被改进。

发明简述

本发明的一个方面涉及一种分离的编码转录激活因子的核酸序列，其选自：

(a)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：48的核酸序列有至少70％同一性的核酸序列；

(b)编码一种多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：49的氨基酸序列有至少50％的同一性。

(c)在低严谨度条件下与(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：48的核酸序列，或者(ii)其互补链杂交的核酸序列，其中将低严谨度条件定义为于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并变性的鲑鱼精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交，并将洗涤条件定义为于50℃在2×SSC、0.2％SDS中洗涤30分钟；

(d)(a)、(b)或(c)的等位基因变体；

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列，其中该亚序列编码一种具有转录激活活性的多肽片段；以及

(f)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列，其中该亚序列编码一种具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽。

表示为SEQ ID NO：1的核酸序列是黑曲霉(Aspergillus niger)prtT基因，其编码在下面所述和实施例中的表示为SEQ ID NO：2的转录因子。