[发明专利]一种定量检测血浆中益母草碱含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，涉及一种检测血浆中益母草碱含量的方法，具体涉及一种液质联用（高效液相色谱串联质谱技术）定量检测血浆中益母草碱含量的方法。

背景技术

中药益母草为唇形科植物益母草（Leonurus helerophyllus sweet）的干燥全草,功效活血、祛痕,调经、消水、清热解毒，常用于治疗月经不调、闭经、产后腹痛、跌打伤痛、水肿等。最近研究表明益母草具有多种生物活性，如研究报道益母草碱的提取物具有改善心肌缺血、增加冠脉血流量，提高心功能，抑制血小板聚集，抗凝、抗血栓形成以及改善大脑缺血等药理作用。

式（Ⅰ）的益母草碱（leonurine, 4-胍基-n-丁酰基丁香酸酯），是益母草生物碱提取物中主要有效成分，文献报道益母草碱具有子宫收缩，抗血小板聚集以及抑制血管平滑肌收缩作用。有研究表明，在现有基础上改良化学合成了益母草碱单体，经实验证实所述的化合物在离体和整体动物实验中对缺血心肌都有良好的保护作用，并推论这可能与其抗氧化抗凋亡的作用相关，因此益母草碱将是一个非常有前景的心血管活性药物。 

目前，益母草碱还处于临床前期研究阶段，要研究其药物代谢动力学，必须建立测定生物样本中益母草碱的含量的方法。而现有文献所报道的主要是应用反向高效液相色谱法（HPLC）或者超高压液相色谱（UPLC）测定益母草的原材料或者中成药制剂中益母草碱的含量；有报道应用HPLC法测定大鼠血浆中益母草碱血药浓度，计算益母草碱静脉注射后其药代动力学参数，但该方法的灵敏度很低，检测限约为0.25μg/mL；有研究在预试验中发现，如果改用口服给药后，应用上述方法无法检测到益母草碱，说明口服给药后益母草碱血药浓度低于此方法的检测限；所以需要建立灵敏度更高，更快速敏捷的方法。因此，建立可靠灵敏的检测血浆中益母草碱含量的方法，尤其是液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量检测血浆中益母草碱含量的方法，能够为益母草碱口服给药后药物代谢动力学的研究打下坚实的基础。

本发明中所述的益母草碱分子式为C₁₄H₂₁N₃O₅，分子量为311，结构式为：

（Ⅰ）

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种定量检测血浆中益母草碱含量的方法，尤其是一种液质联用（高效液相色谱串联质谱技术）定量检测血浆中益母草碱含量的方法。

本发明所述的益母草碱分子式为C₁₄H₂₁N₃O₅，分子量为311，结构式为：

（Ⅰ）

具体而言，本发明的定量检测血浆中益母草碱含量的方法，其特征是：用苯甲酰精氨酸乙酯（BAEE）作为检测物益母草碱的内标（IS），用高氯酸沉淀蛋白方法对血浆样品进行预处理，建立LC-MS/MS方法定量检测血浆中益母草碱含量，按内标法以峰面积，计算血浆中益母草碱血药浓度。

本发明中，通过检测大鼠血浆中益母草碱的含量计算血浆中益母草碱血药浓度。

本发明中，液相色谱采用安捷伦Zorbax SB-C18 柱为固定相，乙腈/乙酸铵缓冲液（10mM 乙酸铵，0.6%乙酸）混合液为流动相，进行等度洗脱，质谱采用电喷雾电离源（ESI），使用多离子反应监测（MRM）对益母草碱进行定量；

本发明方法中，所述的益母草碱的最低定量限可达4ng/mL。

本发明的定量检测血浆中益母草碱含量的方法包括以下步骤：

步骤一 样品预处理

采用沉淀血浆蛋白作为血浆预处理方法，用10%高氯酸作为沉淀剂；

步骤二 液相分离

（1）    流动相：由体积比为25%的乙腈与75%的乙酸铵缓冲液（含10mM乙酸铵，0.6%乙酸）组成；

（2）    色谱柱：采用安捷伦Zorbax SB-C18 柱，色谱柱内径2.1mm，填料粒径5μm，色谱柱长度150mm；

（3）    洗脱方法：采用等度洗脱，流速0.2mL/min，色谱柱温度为27℃；

步骤三 质谱检测