[发明专利]一种检测猪博卡病毒的PCR方法无效
申请号: | 201110063365.5 | 申请日: | 2011-03-16 |
公开(公告)号: | CN102174662A | 公开(公告)日: | 2011-09-07 |
发明(设计)人: | 李彬;何孔旺;温立斌;毛立;张雪寒;倪艳秀 | 申请(专利权)人: | 江苏省农业科学院 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11 |
代理公司: | 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 | 代理人: | 张素卿 |
地址: | 210014*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 猪博卡 病毒 pcr 方法 | ||
技术领域
本发明属于动物病毒学与动物传染病学技术领域。具体涉及一种对猪博卡病毒进行检测的PCR方法。
背景技术
博卡病毒(Bocavirus)是细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属的成员。人博卡病毒最早于2005年在患有下呼吸道疾病的瑞典儿童体内被鉴定(Allander等Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102: 12891-12896)。其基因组大小为5.2kb左右,为单股线状DNA。目前已有许多国家报道了人博卡病毒的流行(Allander, Human bocavirus. J. Clin. Virol, 2008, 41:29-33)。
2009年,瑞典科学家利用随机多重置换扩增方法在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪淋巴结中扩增出了一段长1879 bp的核苷酸序列,该段序列与已知病毒序列比较,发现其完整的NP1基因及部分VP1/VP2基因与人类博卡病毒相近,故将该病毒归类为细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属的猪博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV)(Blomstrom等Detection of a novel porcine boca-like virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome. Virus Res. 2009, 146:125-129)。
目前,猪博卡病毒在患病猪中被发现,而在健康猪体内的检出率较低,在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征的患病猪中其检出率高达88%(Blomstrom 等 Studies of porcine circovirus type 2, porcine boca-like virus and torque teno virus indicate the presence of multiple viral infections in postweaning
到目前为止,对猪博卡病毒在除瑞典和中国以外的世界其它地方的存在与流行情况一无所知。现如今,对猪博卡病毒还没有获得一致认可的敏感且特异的检测方法。
因此,基于以上的研究和当前的需求,申请人根据猪博卡病毒的全基因组序列(GenBank登录号:HQ223038),设计并合成了一对检测猪博卡病毒的引物,建立了检测猪博卡病毒的PCR方法,并发现了该病毒确实存在于我国猪群当中。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种操作简单、特异性强、敏感性高、成本低的检测猪博卡病毒的PCR方法。
技术方案
参考GenBank登录的猪博卡病毒基因组序列(GenBank登录号:HQ223038),设计检测猪博卡病毒PCR方法的引物,其上、下游引物序列分别为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2:
上游引物MPBoV-F: 5’- GGGCGAGAACATTGAAGAGGTTGA -3’,在基因组中的位置为3136-3159 bp;
下游引物MPBoV-R: 5’- CCCCATGGTGTTCTTATTCCGTTC -3’,在基因组中的位置为3385-3408 bp。
检测猪博卡病毒的PCR方法,包括以下步骤:
(1)猪博卡病毒 DNA的提取:取472.5 μl血清,或取100 mg的动物组织,加入1 ml PBS缓冲液进行充分研磨,-20℃反复冻融3次,8000 rpm离心10分钟,取上清液472.5 μl,加入10% SDS 25 μl,20 mg/ml蛋白酶K 2.5 μl,混合均匀后置于37℃消化过夜或50℃水浴4小时,加入等量酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提2次,取上清加2倍体积预冷的无水乙醇于-20℃放置1小时,12000 rpm离心10分钟。弃去上清,沉淀于干燥箱干燥后用20 μl超纯水溶解,即为检测用DNA模板。提取的DNA模板于-70℃保存备用;
(2)将上、下游引物与PCR混合液加入PCR反应管中,混合后加入待检样品DNA;
(3)将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环;
(4)取PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳;
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