[发明专利]一种检测猪博卡病毒的PCR方法

权利要求书

1.检测猪博卡病毒的引物：其上、下游引物序列分别为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。

2.权利要求1所述引物用于检测猪博卡病毒的PCR方法，包括以下步骤：

（1）猪博卡病毒DNA的提取：取472.5 μl血清，或取100 mg的动物组织加入1 ml PBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，8000 rpm离心10分钟，取上清液472.5 μl，加入10% SDS 25 μl，20 mg/ml蛋白酶K 2.5μl，混合均匀后置于37℃消化过夜或50℃水浴4小时，加入等量的体积比为25:24:1的酚：氯仿：异戊醇抽提2次，取上清，加2倍体积预冷的无水乙醇于-20℃放置1小时，12000 rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μl超纯水溶解，即为检测用DNA模板；

（2）将上、下游引物与PCR混合液加入PCR反应管中，混合后加入待检样品DNA；

（3）将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环；

（4）取PCR产物于质量比为1%的琼脂糖凝胶上电泳；

（5）结果判定：有扩增产物约为270 bp条带，为阳性，即猪博卡病毒存在；无扩增产物约为270 bp条带，判为阴性，即猪博卡病毒不存在；

其中步骤（2）所述的PCR混合液包括：采用25 μl的PCR反应体系，在0.2 ml PCR反应管中分别加入10×PCR缓冲液2.5 μl，2.5 mM的dNTP 1.0 μl，25 mM的MgCl₂ 1.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5 μl，DNA模板1 μl，用灭菌超纯水加至总体积，混匀；

步骤（3）的扩增条件为：94℃，5分钟，进行预变性；然后94℃，1分钟，53℃，1分钟，72℃，1分钟共循环35次；最后72℃延伸10分钟。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：阳性对照品为含有VP1/2基因的标准阳性质粒，浓度为2.35×10¹² copies/μl。

4.根据权利要求书2或3所述的方法，其特征在于：所述的扩增产物为273 bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 3。