[发明专利]一种凋落物总DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及凋落物分子生物学，具体的说是一种凋落物总DNA的提取方法。

背景技术

随着DNA分子标记技术和重组DNA技术的发展，制备完整、纯度高的基因组DNA日益显得重要。我们在进行一个物种DNA水平上的研究时，首先遇到的问题就是如何快速、简单、成本不高的获得较完整、纯度较高的基因组DNA。由于植物细胞与动物细胞不同，具有一层坚硬的细胞壁，且含有较多的多糖、色素、脂质和多酚等物质，给植物DNA提取带来很多困难，特别是多糖和多酚类物质不容易与DNA分开。相对于植物新鲜样品，凋落物中植物的次生代谢产物类含量更高，高质量基因组DNA提取更难。为了去除多糖类物质对后续研究的干扰，过去采用费事且价格昂贵的氯化铯密度梯度离心技术(Murray M G，Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acids Res.，1980，8(19)：4321-4325.)。从上世纪90年代以来，很多的文献报道过利用CTAB法提取植物基因组DNA(李希臣，雷学钧，卢翠花，等.高效的植物DNA提取方法[J].生物技术，1994，4(3)：39-41.；卢扬江，郑康乐.提取水稻DNA的一种简易方法[J].中国水稻科学，1992，6(1)：47-48.；邹喻苹，汪小全，雷一丁，等.几种濒危植物及其近缘类群总DNA的提取与鉴定[J].植物学报，1994，36(7)：528-533.；Cheng FS，Brown SK，Weeden N F.ADNA extraction protocol from various tissues in woody species[J].HortScience，1997，32(5)：921-922.；Edwards K，Johnstone C，Thomson J.A simple and rapid method for the preparation of plant genomie DNA for PCR analysis[J].Nucleic Acids Res，1991，19(6)：1349.；Thomson D，Henry R.Use of DNA from dry leaves for PCRand RAPDanalysis[J].Plant Molecular Biology Reporter，1993，11(3)：202-206.；王军，贺普超.山葡萄基因组DNA提取及RAPD鉴定[J].果树科学，2000，17(2)：79-82.)，所提取的DNA可用于RAPD，ISSR等标记研究。但是对于凋落物基因组DNA的提取未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种凋落物总DNA的提取方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

1)将已研成粉末、预冷的凋落物加入于CTAB提取缓冲液中混匀(1g～2g粉末加入500ul～650μLCTAB)，于64-66℃水浴5-10min；而后以12000-13000r·min^-1离心5-10min，收集沉淀，待用；

2)将步骤1)所得沉淀加入到过量的CTAB提取缓冲液混匀，64-66℃水浴5-10min，待用；

3)将步骤2)水浴后沉淀抽提2-4次，抽提过程为将沉淀加入等量的氯仿-异戊醇中混匀，以12000-13000r·min^-1离心5-10min，收集上清液；

4)将步骤3)抽提后上清液中加入上清液2-2.5体积的预冷无水乙醇和上清液0.2-0.3倍体积的NaAC混匀，静止放置15-30min，而后以10000-12000r·min^-1离心5-10min，所得沉淀，即为凋落物总DNA。

所述步骤4)所得凋落物总DNA采用70％(体积分数)乙醇洗涤而后室温干燥，将干燥DNA沉淀溶于去离子水中保存。

所述步骤1)凋落物于-40℃或-20℃冰箱冷冻，而后将其于液氮中研成粉末。所述步骤1)和2)水浴时每隔2分钟颠倒混匀缓冲液，所述步骤3)中氯仿-异戊醇，按体积比为24∶1混匀。

凋落物是指未经化学处理的森林凋落物，包括各种腐叶、树叶。

本发明所具有的优点：