[发明专利]一种人类松弛素-2 Relaxin的固相合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人类松弛素-2的合成方法，特别涉及一种人类松弛素-2的固相合成方法。

背景技术

人类松弛素-2，通常简称为RLN2，药物名称也被命名为Relaxin，即松弛肽，是人体内发现的一种多肽激素。人类松弛素-2由两条链组成，A链含24个氨基酸且存在链内二硫键，B链含29个氨基酸，A链与B链通过两个二硫键相连，其结构式如下：

近年来的一系列研究发现，人类松弛素-2对心力衰竭等心血管疾病具有显著的治疗作用，能够扩张体循环血管、扩张肾脏血管并增加动脉顺应性。美国专利US5166191已公开了人类松弛素用于治疗心血管疾病尤其是急性和慢性心力衰竭的方法专利，中国专利文献CN1052655C(申请号89100947.7，申请日1989.02.25，优先权日1988年2月26日)公开了一种用于调节哺乳动物生殖生理的含人类松弛素的液体制剂。

人类松弛素-2的结构及分子量与人类胰岛素相似，分子量较大，且存在三个二硫键，因此，目前主要采用基因重组技术生产，美国专利US4758516已公开了编码人Relaxin H₂的DNA。但是基因重组技术生产工艺复杂，耗时且费用昂贵，不利于人类松弛素-2的大量生产，无法满足市场需要。因此，需要研发人类松弛素-2的化学合成方法。

多肽的化学合成方法目前有固相合成和液相合成两种，其中固相合成法用于多肽合成存在诸多优点：简化并加速了多步骤合成的操作；反应在简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相连的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤完成中间的纯化，避免了液相多肽合成中冗长的重结晶或柱分离步骤，可避免中间体分离纯化时的损失；使用过量反应物，促使个别反应完全，以便终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚集；固相载体上的肽链和轻度交联的聚合链紧密混合，彼此产生相互的溶剂效应，对多肽自聚集热力学不利而对反应适宜。

1991年生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)发表的文献“利用固相合 成和位点定向的链组合全合成人类松弛素及人类松弛素衍生物”(Total synthesis of human relaxin and human relaxin derivatives by solid-phase peptide synthesis and site-directed chain combination，1991年第26卷第17期第10754-10761页)公开了一种人类松弛素-2的固相合成方法，该方法中，松弛素-2的A链采用Fmoc法合成，B链采用Boc法合成，合成过程需要采用HF处理两次，并且需要三步进行链的组合，不同的二硫键采用不同的保护基、不同的脱保护剂，因此操作极其复杂，并且产率很低，以使用的人类松弛素B链计算，总产率仅为1.4％。可以认为，从经济学上讲，其在大规模生产中不可接受。

将松弛素-2的A链和B链随机组合可以使合成较为简单且产率较高。但是，据报道，RLXB水溶性极差，用Fmoc-氨基酸进行固相合成非常复杂。

2010年，多肽科学杂志(Journal of Peptide Science)发表的文献“一种优化的人类松弛素-2的化学合成方法”(An optimized chemical synthesis of human relaxin-2，2010年第16卷第四期第200-211页)公开了一种人类松弛素-2的化学方法，该方法中，松弛素-2的A链和B链均采用Fmoc法合成，二硫键的形成采用随机组合法，各个半胱氨酸的侧链采用同一保护基。这一方法可提高松弛素-2的产率，但产率仅为48％，且松弛素-2的B链的合成工艺复杂，不利于工业化生产。

迄今为止，单链小分子多肽的合成技术已经成熟，并且可利用多肽合成仪实现自动化合成，虽然松弛素-2的A链和B链的固相合成已经可以得到较好的收率，但是将A链和B链链接制备松弛素-2固相合成方法收率仍较低。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种步骤简便、收率高、适用于工业大规模生产的人类松弛素-2的固相合成方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种人类松弛素-2的固相合成方法，包括以下步骤：

1)单环A链的固相合成：

a、将Wang树脂在二氯甲烷中溶胀，用N-甲基吡咯酮洗涤树脂；