[发明专利]一种人类松弛素-2 Relaxin的固相合成方法

权利要求书

1.一种人类松弛素-2的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)单环A链的固相合成：

a、将Wang树脂在二氯甲烷中溶胀，用N-甲基吡咯酮洗涤树脂；

b、以Wang树脂为载体，以由1-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺三者按物质的量比1∶3∶1配制的混合液为偶联剂，以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，进行程序反应，依次进行缩合反应连接Fmoc-Cys(4-MeBzl)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Z)-OH、Fmoc-Thr(Bzl)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Bum)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Z)-OH、Fmoc-Asn(Tmob)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH、Fmoc-Leu-OH和Fmoc-pGlu-OH，得pGlu-Leu-Tyr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ala-Leu-Ala-Asn(Tmob)-Lys(Z)-Cys(Trt)-Cys(Acm)-His(Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Arg(Pmc)-Ser(Bzl)-Leu-Ala-Arg(Pmc)-Phe-Cys(4-MeBzl)-O-树脂，其中每次缩合反应中Fmoc保护氨基酸的投料量与树脂用量的物质的量比为(1-2)∶1，每次缩合反应中1-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐用量与Fmoc保护氨基酸用量的物质的量比为1∶1；

c、将pGlu-Leu-Tyr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ala-Leu-Ala-Asn(Tmob)-Lys(Z)-Cys(Trt)-Cys(Acm)-His(Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Arg(Pmc)-Ser(Bzl)-Leu-Ala-Arg(Pmc)-Phe-Cys(4-MeBzl)-O-树脂加入由溴化氢和乙酸按体积比3∶7配成的混合溶液中，室温下反应20分钟脱除Cys(Trt)的Trt保护基，将树脂抽干用二氯甲烷洗涤树脂后，将pGlu-Leu-Tyr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ala-Leu-Ala-Asn(Tmob)-Lys(Z)-Cys(Trt)-Cys(Acm)-His(Bum)-Val-Gly-Cys(Trt)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Arg(Pmc)-Ser(Bzl)-Leu-Ala-Arg(Pmc)-Phe-Cys(4-MeBzl)-O-树脂加入由水、乙腈和二甲基亚砜按体积5∶4∶1配制的混合液，室温下搅拌4小时进行环化反应，其中溴化氢和乙酸的混合溶液用量为每克树脂使用4-9ml，水、乙腈、二甲基亚砜混合液的用量为每克树脂使用5ml；

d、保留Cys(4-MeBzl)的4-MeBzl保护基，脱除其他侧链保护基，将连接肽链的树脂加入由三氟乙酸、硫代苯甲醚、苯酚、二巯基乙醇和水按体积70∶8∶10∶5∶7配制的混合溶液，静置2小时，制成存在链内单环的A链；

2)B链的固相合成：

a、将Wang树脂在二氯甲烷中溶胀，用N-甲基吡咯酮洗涤树脂；

b、以Wang树脂为载体，以由1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、1-羟基苯并三氮唑和1-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐按物质的量比为1∶1∶4配制的的混合液物为偶联剂，以由盐酸胍、N，N-二甲基甲酰胺和乙醇按质量比为6∶1∶7配制的混合溶液为溶剂，进行程序反应，依次进行缩合反应连接Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Thr(Bzl)-OH、Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Cys(4-MeBzl)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Z)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH，得H-Asp(OtBu)-Ser(Bzl)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Z)-Leu-Cys(Acm)-(Dmb)Gly-Arg(Pmc)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pmc)-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys(4-MeBzl)-(Dmb)Gly-Met-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Trp(Boc)-Ser(Bzl)-O-树脂，其中每次缩合反应中Fmoc保护氨基酸的投料量与树脂用量的物质的量比为(1-4)∶1，每次缩合反应中1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐用量与Fmoc保护氨基酸用量的物质的量比为1∶1；

c、将H-Asp(OtBu)-Ser(Bzl)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Z)-Leu-Cys(Acm)-(Dmb)Gly-Arg(Pmc)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pmc)-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys(4-MeBzl)-(Dmb)Gly-Met-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-Trp(Boc)-Ser(Bzl)-O-树脂脱除部分保护基制成H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-(Dmb)Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys(4-MeBzl)-(Dmb)Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-O-树脂，然后将连接肽链的树脂加入由三氟乙酸、硫代苯甲醚、苯酚、二巯基乙醇和水按体积比为70∶8∶10∶5∶7配制的混合溶液，静置3小时，得H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-(Dmb)Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys(4-MeBzl)-(Dmb)Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH；

3)人类松弛素-2的化学合成：将步骤1)与步骤2)制备的肽链按物质的量比为1∶1.2溶于由二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、三氟乙酸体积比1∶1∶3组成的溶剂系统搅拌均匀，室温静置1小时，然后匀速搅拌10小时，随后加入与溶剂系统中三氟乙酸等体积的二氯甲烷，室温静置1-4小时，分离沉淀物，将沉淀物洗涤后溶于10mol/L的盐酸胍溶液，然后加入体积比为5∶95的三氟乙酸与水的混合溶液调节pH为3.0，用C18填料的半制备反相高效液相色谱柱纯化、洗脱、干燥即得。