[发明专利]检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，涉及一种时间分辨免疫荧光（Time Resolved Fluoroimmunoassay,TRF）检测方法，具体为应用时间分辨免疫荧光方法检测样品中的Glypican-3蛋白的浓度。人外周血中Glypican-3蛋白浓度的增加与原发性肝癌的发生发展存在密切关联，运用本试剂盒能够对原发性肝癌的发生发展起到诊断作用。

背景技术

原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位。特别是在乙型肝炎病毒感染的人群中，其发生率相当高。目前诊断上分为影像学诊断和血清学诊断。影像学诊断包括CT、MRI和B超等在内的仪器能够发现最小1cm左右的病灶。而对于影像学不能判断和不能发现的肝脏肿瘤，血清学诊断发挥了特别的优势。目前的血清学诊断包括AFP、γ-谷氨基酰转移同工酶II和异常凝血酶原等，这些检测在特异性和敏感性方面都有待于提高。Glypican-3是硫酸乙酰肝素多糖蛋白-3，它以磷脂酰肌醇糖基形式（GPI）锚定在肝脏细胞膜表面，形成一个球茎样结构，球形部分含有一个核心的CRD结构域，茎部为硫酸乙酰肝素多糖，其C末端以GPI形式锚定于细胞膜上。Glypican-3具有促进细胞生存和增殖的作用，Glypican-3基因敲除的小鼠其细胞生长、胚胎发育都受到损害。Glypican-3在IGF，FGF，BMP和 Wnt信号转递途径中都发挥着多种作用。Glypican-3在胚胎及胎儿期的肝脏中高度表达，而成人肝脏细胞则不表达。近年来发现，它在原发性肝癌中呈现高表达，其肝癌组织阳性率达到90％，对原发性肝癌具有重要的诊断价值。

目前，临床应用的Glypican-3检测方法主要为ELISA方法，但它的灵敏性不够，而且在定量的浓度检测方面缺乏稳定性。Glypican-3在人外周血中的浓度非常低，需要一种高灵敏的方法来检测。时间分辨免疫荧光（Time Resolved Fluoroimmunoassay, TRF）检测方法是一种成熟的免疫分析方法，具有高特异、高灵敏的优点，是在临床医学和检验医学等诸多方面得到十分广泛的应用，是目前取代放射性免疫分析的一种定量检测方法。它的基本原理是利用三价稀土离子（如Eu³⁺）作为示踪物，延迟检测寿命较长的特异性激发荧光以排除非特异性及背景荧光的干扰，即测定复合物中的稀土离子被激发的延迟荧光强度，从而确定待测蛋白的浓度。使用荧光增强液的TRF能够检测到皮克（pg，10^－12g/ml）水平的蛋白，因此，本试剂盒采用TRF的方法来检测Glypican-3的浓度，是考虑了多方面的优点。

现在国际上还没有报道专门用于检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光方法，也没有相应的试剂盒提供，因此，该试剂盒的开发和应用，是填补了这方面的空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏特异的检测样本中Glypican-3蛋白浓度的试剂盒及其制备方法。

本发明的目的是通过以下方法实现的：在酶标板中用包被抗体包被，封闭后加入待测样品孵育，洗板，加入检测抗体孵育，再次洗板后加入Eu^3＋标记的链亲和霉素孵育，然后洗板加入荧光增强液，振荡5分钟后用337nm波长光激发，延时200微秒在615nm波长处检测发射荧光值；通过标准品的浓度和相应的荧光值绘制标准曲线，待检样品中的Glypican-3浓度就可以通过它的荧光值并对应标准曲线得到。

本发明检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光试剂盒，其包括以下组成：

（1）包被缓冲液为磷酸盐缓冲液（PBS），其成分为140mM NaCl，2.7mM KCl， 10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH值为7.4；

（2）封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；

（3）洗涤液为含0.05%Tween-20的Tris-HCl 缓冲液（TBS），其成分为50mM的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.8），0.05%Tween-20；

（4）加样缓冲液的成分为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；

（5）荧光增强液（Enhancement Solution）；