[发明专利]检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光试剂盒

权利要求书

1.检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于包括以下组成：

（1）包被缓冲液为磷酸盐缓冲液（PBS），其成分为140mM NaCl，2.7mM KCl， 10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH值为7.4；

（2）封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；

（3）洗涤液为含0.05%Tween-20的Tris-HCl 缓冲液（TBS），其成分为50mM的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.8），0.05%Tween-20；

（4）加样缓冲液的成分为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；

（5）荧光增强液（Enhancement Solution）；

（6）检测缓冲液（Assay Buffer）为50mM的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.8），其中含有1%BSA，1%bovine globulin，0.05%Tween 40，DTPA； 

（7）包被抗体为羊抗人Glypican-3多抗（Sheep Anti-Human Glypican-3 polyantibody），储存浓度为1μg/μl；

（8）检测抗体为生物素化的羊抗人Glypican-3多抗（Biotinylated Sheep Anti-Human Glypican-3 polyantibody），储存浓度为50ng/μl；

（9）Eu^3＋标记的链亲和霉素（Eu^3＋-labeled streptavidin），储存浓度为0.1μg/μl；

（10）标准品，重组人Glypican-3蛋白（Recombinant Human Glypican-3），浓度为100μg/μl。

2.如权利要求1所述检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光试剂盒的使用方法，其特征在于以下步骤：

（1）用PBS稀释包被抗体－羊抗人Glypican-3多抗（Sheep Anti-Human Glypican-3 polyantibody）至浓度为4ug/ml，以100μl/孔加入96孔酶标板，4℃过夜；

（2）弃去包被抗体，300μl/孔洗涤液洗涤三次，加入封闭液200μl/孔，37℃孵育1h；

（3）弃去封闭液，300μl/孔洗涤液洗涤三次，加入待测培养上清样品和倍比稀释的标准品100μl/孔，37℃孵育1h；

（4）弃去样品和标准品，300μl/孔洗涤液洗涤三次；

（5）用加样缓冲液稀释检测抗体－生物素化的羊抗人Glypican-3多抗（Biotinylated Sheep Anti-Human Glypican-3 polyantibody）至浓度为75ng/ml，以100μl/孔加入稀释好的检测抗体，37℃孵育1h；

（6） 弃去检测抗体，300μl/孔洗涤液洗涤三次；

（7）用检测缓冲液（Assay Buffer）稀释Eu^3＋标记的链亲和霉素（Eu^3＋-labeled streptavidin），终浓度为500ng/ml ，以100μl/孔加入酶标板，37℃避光孵育1h；

（8） 弃去Eu^3＋标记的链亲和霉素（Eu^3＋-labeled streptavidin），300μl/孔洗涤液洗涤四次

（9） 加入荧光增强液（Enhancement Solution） 200μl/孔，室温避光缓慢水平摇动5min；

（10） 读板：设定激发光波长（Excitation wavelength）为337nm，发射光波长（Emission wavelength）为615nm，延时200微秒测定615nm处的荧光值；

（11）利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；

（12）通过标准曲线和未知浓度样品的荧光值计算待测样品中的Glypican-3的浓度。