[发明专利]一种鉴定山羊早期胚胎性别的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及利用PCR技术扩增山羊AMEL基因进行早期胚胎性别鉴定的方法。

背景技术

早期胚胎性别鉴定技术，是家畜胚胎移殖技术的一项重要内容，也是实现家畜后代性别控制的主要途径之一。早期的一些性别鉴定方法如免疫学方法、细胞学方法等，由于所需时间较长、或者对胚胎伤害较大、鉴定的准确率不高等种种原因而无法应用于生产实践中。近年来，随着性别鉴定技术的不断发展，性别控制主要采取两条途径：X精子与Y精子的分离和早期胚胎性别的鉴定；虽然流式细胞仪已能成功分离X、Y精子，但其成本高，分离效率低，暂时还难以在规模化生产中应用。而随着胚胎移植技术的发展，特别是PCR技术的出现，使早期胚胎性别鉴定成为目前最具实用价值的一项性别控制技术。

用于胚胎性别鉴定的PCR法有多种，起初，利用PCR反应体系对哺乳动物进行性别鉴定是对SRY基因(位于Y染色体上的特有序列)的扩增。然而，SRY基因只显示一条带，当实验过程中SRY基因条带没有出现时，不能判定是雌性样本还是实验过程中出现了错误。虽然有同时存在于雌性和雄性中的基因(像ZFX/Y)作阳性对照，但需要增加时间和材料。利用AMEL基因进行性别鉴定可以克服上述缺点。AMEL基因同时存在于X和Y染色体上的同源区，根据其内含子长度在两条性染色体上的不同，能扩增出不同长度的基因 片段，在牛上已用于性别鉴定。根据AMEL基因在X和Y染色体同源区上存在不同程度碱基缺失的特点，设计巢式引物，雌性PCR产物经过电泳检验只得到对应X染色体的一条雌雄共有条带，而雄性得到分别对应于X染色体的雌雄共有条带和对应于Y染色体的雄性特有条带。

目前，多采用SRY基因对山羊进行性别鉴定，采用AMEL基因的却鲜有报道。

发明内容

针对现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的是提供一种鉴定山羊早期胚胎性别的方法，该方法是利用引物对山羊AMEL基因巢式PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，出现两条带者为雄性样品，出现一条带者为雌性样品，不需要另外设计内标引物作为阳性对照。

实现上述发明目的的技术方案是一种鉴定山羊早期胚胎性别的方法，具体包括下列步骤：

1)取少量山羊发情后第7～8天胚胎做为样品；

2)将胚胎样品用无钙镁的磷酸缓冲液中洗涤三次，在100℃灭菌超纯水煮沸10min，然后5000g离心3min，钭上清液直接作为模板进行PCR反应；

3)在15μL PCR Mix液中加入上下游巢式外引物和5μL模板，预变性94℃ 5min；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，共22个循环；最后72℃延伸5min；

所述的上游巢式外引物：5′-CATGGT GCCAGCTCAGCAG-3′

所述的下游巢式外引物：5′-CCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3′

4)在3μL PCR产物中加入7μL PCR Mix和上下游巢式内引物，预变性 94℃ 5min；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，共40个循环；最后72℃延伸5min，停止反应；

上游巢式内引物：5′-CAGCAACCAATGATGCCAGTTC-3′

下游巢式内引物：5′-GTCTTGTCTGTTGCTGGCCA-3′

5)将扩增产物于1.5％的琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像仪中观察，出现两条带者为雄性样品，一条带者为雌性样品。

所述的PCR Mix液中包括50mmol/L KCl、20mmol/L Tris-HCl、3mmol/LMgSO₄、400mmol/L dNTPs和0.1U/μL Taq DNA聚合酶。

所述的电泳条件是75V，30min。

本实验采用AMEL基因对山羊早期胚胎进行性别鉴定，目的是建立一种更加快捷、准确的山羊胚胎性别鉴定方法，推进山羊性别控制技术在生产中的应用。

胚胎性别鉴定技术与MOET(超数排卵和胚胎移植)技术结合，可使早期胚胎性别鉴定成为目前最具实用价值的一项性别控制技术。

与目前的性别鉴定技术相比，本发明的优点在于：

1)利用该巢式PCR引物进行PCR鉴定时，出现两条带者为雄性样品，一条带者为雌性样品，不需要另外设计内标引物这样就不存在性控引物和内标引物扩增效率不同的问题，同时由于只需使用2条引物，一能简化实验操作，二能降低实验成本，三能减少引物太多导致交叉产生引物二聚体等不良因素。