[发明专利]石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及到一种石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和ELISA检测试剂盒的制备和应用。

背景技术

目前，麻痹性贝类毒素(Paralytic shellfish poison，PSP)已成为世界上分布范围最广、发生频率最高、危害程度最大的一类海洋生物毒素，它通过影响钠离子通道而抑制神经的传导。而石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)为麻痹性贝类毒素的主要成分之一，是四氢嘌呤的一种衍生物，其外部形态是呈白色、吸湿性很强的固体，溶于水，微溶于甲醇和乙醇。STX及天然衍生物所构成的PSP有很高的致死率，STX对成年人轻度中毒量为110μg，致死剂量为540～1000μg，LD₅₀为9μg/kg(小鼠，ip)。

贝类毒素的分析方法主要有小鼠生物测试法、HPLC法及免疫方法等。小鼠生物测试法是是国际上都能接受的唯一的方法。该方法在检测样本总毒性方面相当成功，但此种方法不能确知毒素的组成及含量，且重复性差，灵敏度不高。近几年发展起来的HPLC法及其联用技术，具有灵敏、高效的特点，能够提供更多的毒素信息，是PSP毒素检测的主要手段，但存在成本高，费时，需要较高的仪器设备及分析技术等缺点。而酶联免疫吸附测定技术(ELISA)具有简便、快速、灵敏、成本低廉等特点，ELISA法与传统的动物生物法及色谱方法相比较，更快速经济，可以满足大批量样品的快速筛查需要。

国内对麻痹性贝毒中的膝沟藻毒素(gonyautoxin，GTX)研究的比较多，暨南大学的向军俭制备了抗麻痹性贝毒素GTX2，3的单克隆抗体，同时也比较了间接竞争和直接竞争ELISA方法的灵敏度和检出限。但对STX的酶联免疫吸附法研究还没有开展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和ELISA检测试剂盒的制备和应用，将制备的抗体用于石房蛤毒素的检测，以弥补现有技术的不足。

制备抗体的关键是制备人工免疫抗原，因为石房蛤毒素是一种相对分子质量只有299的小分子半抗原，没有抗原性，不能刺激动物体产生相应的抗体，需要和某种大分子的物质偶联形成完全抗原，小分子的半抗原就成为新的偶联物的抗原决定簇，这样小分子物质就具有了抗原性。而制备人工抗原要选择合适 的载体蛋白，本发明选择碳化二亚胺法，载体蛋白选用卵清白蛋白(OVA)，将石房蛤毒素上的氨基与卵清白蛋白(OVA)上的羧基相连，采用梯度法透析后得到高纯度的石房蛤毒素免疫抗原STX-OVA。同时本发明还选择用牛血清白蛋白(BSA)来制备包被抗原STX-BSA，在制备ELISA试剂盒时需要用包被抗原包被酶标板。

本发明的技术方案如下：

一、免疫抗原STX-OVA，其结构式为：

免疫抗原STX-OVA和包被抗原STX-BSA的制备方法为：

利用碳化二亚胺法，碳化二亚胺是一种化学性质非常活跃的双功能试剂，它们既可与半抗原上的羧基又可与半抗原上的氨基缩合。碳化二亚胺先于石房蛤毒素上的氨基结合，再加入载体蛋白，石房蛤毒素上的氨基与体蛋白上的羧基相连，形成酰胺键，形成新的复合物，同时碳化二亚胺从复合物上脱落。反应中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为催化剂，可以加速反应的进行。反应完后梯度透析得到石房蛤毒素人工抗原。制备步骤如下：

(1)将石房蛤毒素(STX)溶于二甲基亚砜(DMSO)中配制成0.1μg/μL的STX母液；将水溶性碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和卵清白蛋白(OVA)用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)分别配制成1mg/mL的工作液；

(2)取100μL STX母液，加入20μL EDC工作液和12μL NHS工作液，STX、EDC、NHS反应的摩尔比为1∶2-3∶1-2，室温震荡反应3h，获得最初反应液；

(3)载体蛋白选择卵清白蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)，OVA作为免疫抗原载体，BSA作为包被抗原载体，用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)将两种载体蛋白配成1mg/mL的工作液。

(4)STX和载体蛋白反应的最佳摩尔比为10∶1；将(2)步骤中的反应物加入到100μL的载体蛋白工作液中，4℃震荡反应12h，获得最终反应液；