[发明专利]石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种石房蛤毒素人工抗原，为石房蛤毒素人工抗原STX-OVA，其结构式为：

2.如权利要求1所述的石房蛤毒素人工抗原的制备方法，其特征在于是将石房蛤毒素上的氨基与卵清白蛋白OVA上的羧基相连得到石房蛤毒素人工抗原，包括以下步骤：

(1)将石房蛤毒素STX溶于二甲基亚砜DMSO中，配成0.1μg/μL的STX母液；将水溶性碳化二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS用0.01M pH7.5磷酸盐缓冲液PBS，分别配制成1mg/mL相应工作液；

(2)取100μL STX母液，加入20μL EDC工作液和12μL NHS工作液，室温震荡反应3h制成最初反应液；

(3)用0.01M pH7.5的PBS缓冲液将卵清白蛋白配成1mg/mL的卵清白蛋白工作液；

(4)将步骤(2)中的最初反应液加入到100μL卵清白蛋白工作液中，震荡反应12h获得最终反应液；

(5)将上述的最终反应液转移到透析卡中，用300mL 0.01M pH7.5的PBS缓冲液和DMSO的混合液透析72h，每12h换液1次，透析完后取出反应物即制得石房蛤毒素人工抗原。

3.如权利要求2所述的石房蛤毒素人工抗原的制备方法，其特征在于STX∶EDC∶NHS反应的摩尔比为1∶3∶2。

4.如权利要求2所述的石房蛤毒素人工抗原的制备方法，其特征在于上述的透析是采用梯度透析法，第一次透析的溶液中PBS缓冲液和DMSO的体积比为100∶4-5，第二次透析的体积比为100∶3-4，第三次透析的体积比为100∶2-3，第四次透析的体积比为100∶1-2，第五次透析的体积比为100∶0.5-1，以后透析的溶液不加DMSO。

5.权利要求1所述的石房蛤毒素人工抗原用于制备石房蛤毒素抗体。

6.如权利要求5所述的石房蛤毒素抗体，其特征在于是用石房蛤毒素人工抗原STX-OVA作为免疫抗原免疫小鼠，分离纯化血清得到的石房蛤毒素多克隆抗体。

7.权利要求6所述的石房蛤毒素抗体的制备步骤如下：用STX-OVA免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，首次免疫用200μL STX-OVA与等体积弗氏完全佐剂，充分乳化后制成乳浊液，腹腔注射小鼠，之后每隔两周取同量STX-OVA与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，腹腔注射；免疫三次后取尾血测定小鼠血清效价，若效价不高，继续免疫；待效价大于要求值后取血，室温放置30min，8000r/min离心20min，取上层血清，用蛋白A抗体离心纯化试剂盒纯化血清，得到石房蛤毒素多克隆抗体。

8.权利要求6所述的石房蛤毒素多克隆抗体应用于制备石房蛤毒素的酶联免疫检测试剂盒。

9.如权利要求8所述的检测石房蛤毒素的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒依间接竞争ELISA原理研制而成，包括：

a、ELISA板条：每个试剂盒含4块真空包装的ELISA板，每块板含包被抗原包被的可拆卸的ELISA微孔板条，规格为8孔×12条；

b、洗涤液PBS-T：10倍浓缩的pH为7.4的含0.1％体积分数的吐温20的PBS溶液200mL；

c、纯化的石房蛤毒素多克隆抗体血清5mL；

d、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG酶标二抗1mL；

e、底物显色液50mL：配制方法为取50μL TMB溶液+10mL底物缓冲液十10μL 30％过氧化氢，混匀；底物缓冲液的配制为称取柠檬酸19.2g加水至1000mL，为甲液；称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000m L，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL即为底物缓冲液；

f、终止液：2M硫酸溶液10mL；

g、石房蛤毒素标准抗原液1mL，浓度为9.65μM/L；

h、稀释液：0.01M pH为7.5的PBS溶液500mL。