[发明专利]rDNA ITS-D3区核苷酸序列在建立药用植物DNA条形码鉴别系统中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及包含核酸的检测和应用方法，具体涉及利用核苷酸序列鉴别药用植物的方法。

背景技术

药用植物是中药材的原植物，是一些具有保健和药用价值的植物物种。据统计，我国有11146种药用植物(占全部中药资源的87％)，分属383科，2309属。对这一万多种药用植物进行快速、准确鉴定是摆在我国中医药工作者面前的一项紧迫而艰巨的任务。药用植物现有的鉴别方法主要根据形态特征来鉴别，通过采集待鉴定样品各器官(如花、果实、种子、根、茎、叶)或组织的形态特征，查阅药用植物文献资料、图片及标本，对照比较后得出鉴定结果。这一方法易受植物生长发育阶段、环境条件及鉴定人员的经验影响，鉴定效率较低，而且对一些形态相似的药用植物容易判断错误。

随着现代分子生物学特别是DNA测序技术的迅速发展，国际上开始发展DNA条形码技术(DNA barcoding)来鉴别物种。DNA条形码技术是以物种细胞中的一段短的标准的DNA区域作为条形码标记，对生物物种进行准确、快速、自动鉴定的技术。该技术直接分析植物的基因型而非表现型，鉴别结果不受环境因素、样品形态和材料来源的影响，可以确保药材的基原真实。

目前国际上已采用CBOL植物条形码工作组(CBOL Plant Working Group.，A DNA barcodefor land plants.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2009，106：12794-12797.)提出的以质体基因matK+rbcL组成的双位点植物DNA条形码方案。使用时，用户采用通用引物PCR扩增matK和rbcL两个位点并测序，将获得的matK和rbcL序列提交到生物条形码数据库BOLD(http://www.boldsystems.org)进行查询，即可获得样品的生物分类信息。但是这一标准方案在鉴别植物物种时尚存在以下缺点：1.需要测试matK和rbcL两个位点，工作量大，成本较高；2.rbcL虽然有通用引物，但序列在物种中进化速率较慢，而matK虽然序列进化速率较快，但缺乏通用引物，这些缺点使matK+rbcL只能区别约70％的植物物种，鉴别能力不理想。

植物核糖体DNA(rDNA)通常呈18S-5.8S-26S顺反子排列于染色体上，在基因组中高度重复(几百至几千次)。位于18S与5.8S之间的内转录间隔区1(ITS1)以及位于5.8S与 26S之间的内转录间隔区2(ITS2)因具有较高的序列变异速率，已被广泛用于植物系统发生、遗传多样性等研究(Alvarez，I.，Wendel，J.F.，2003.Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference.Mol.Phylogenet.Evol.29：417-434.)。最近，一些学者认为ITS2适合作为植物DNA条形码位点，用来区别不同植物物种(Shilin Chen，Hui Yao，Jianping Han，Chang Liu，Jingyuan Song，Linchun Shi，Yingjie Zhu，Xinye Ma，Ting Gao，Xiaohui Pang，Kun Luo，Ying Li，Xiaocheng Jia，Yulin Lin，Christine Leon.Validation of the ITS2Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species.PLOSONE.2010，15(1)：e8613)。但是单独采用ITS2作为植物DNA条形码存在以下缺点：1.ITS2序列在许多物种中存在多个不同的拷贝，需对PCR产物进行克隆并挑取多个阳性克隆测序；2.由于缺少保守区，ITS2序列在分类广泛的物种中难以准确比对。