[发明专利]一种运用高速逆流色谱从大蒜中分离制备甾体皂苷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及天然药物的分离方法，具体涉及一种用高速逆流色谱联用蒸发光散射检测器从大蒜中分离制备4个大蒜甾体皂苷的方法。

背景技术

大蒜是百合科葱属植物蒜(Allium sativum L.)的鳞茎，是人们日常餐桌上不可缺少的调味品，也常被人们当作一种保健药物来预防感冒、提高身体免疫力及预防心血管系统疾病。其含有丰富的挥发性含硫化合物以及甾体皂苷是主要活性成分，并被开发出大蒜干粉、大蒜挥发油胶囊等药物。现代人们日益注重自己的身体保健，大蒜作为一种药食同源的植物，风味、疗效俱佳，无毒副作用，开发利用大蒜中的功能成分，已成为大蒜研究的重要方向。

现代药理和临床研究发现，大蒜中的甾体皂苷有抗血小板聚集和提高纤溶活性、延长血液凝固时间的药理活性，表明有防止和延缓血栓的形成，并使已形成的血栓溶解消失，治疗血栓病的作用(J P Peng，H Chen，YQ Qiao，L R Ma，T Narui，H Suzuki，T Okuyama，a.H.Kobayashi.Two new steroidal saponins from allium sativum and their inhibitory effects on blood coagulability.yaoxuexuebao，1996，31：607-612)。大蒜中的甾体皂苷结构相似，且没有紫外吸收，传统的色谱分离手段不能实现对其高效、快速分离，并且大蒜中甾体皂苷含量较低，传统研究中，通常使用多步硅胶柱层析以及联用制备液相等方法分离制备大蒜中甾体皂苷，不仅耗费时间长，不能在线检测，也会造成死吸附，损失较大，得率较低。

高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)是一种连续高效的液-液分配色谱技术，由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，样品的理论回收率为100％，特别适合于天然物活性成分的分离。

蒸发光散射检测器(Evaporative light Scattering，ELSD)是一种通用型检测器，常用于测定无紫外吸收或紫外吸收较弱的化合物的检测。ELSD消除了常见于传统HPLC检测方法中的难点，不同于紫外和荧光检测器，ELSD的响应不依赖与样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。

发明内容

本发明公开了一种用高速逆流色谱联用蒸发光散射检测器从大蒜中在线分离大蒜中1、2、3和4四个甾体皂苷的方法，四个甾体皂苷的结构式如下：

其中Gal为β-半乳糖，Glc为β-葡萄糖，Xyl为β-木糖。

本发明采用高速逆流来分离大蒜中甾体皂苷化合物，并在线联用蒸发光散射检测器监测分离，获得了很好的效果。

本发明将大蒜甾体总皂苷利用高速逆流色谱联用蒸发光散射检测器，依据蒸发光散射检测器谱图分别收集流分，其中高速逆流色谱的固定相和流动相由正丁醇、冰醋酸和醋酸铵水溶液混合后分层，上相作为固定相，下相作为流动相，分离得到大蒜中1、2、3和4四个甾体皂苷。

逆流分离中溶剂系统的选择是最关键的，常用样品在溶剂系统中的分配系数K来指导选择溶剂系统。发明人尝试了多种溶剂系统，部分如表1中所述A、B、C、D四个逆流溶剂系统，目标化合物在四种溶剂系统中的分配系数K见表1。

表1.四种目标化合物在不同溶剂中的分配系数

从表1可见，溶剂系统A不适合分离，而系统B、C在分离中会产生很严重的乳化而致分离失败，溶剂系统D是在C基础上加入缓冲盐得到的，其乳化干扰较小，可以实现分离，在此技术上形成本发明。

本发明更为优选的方法包括：

a.将高速逆流色谱仪与蒸发光散射检测器连接；

b.将正丁醇、冰醋酸和醋酸铵水溶液混合成混合溶剂；

c.将大蒜甾体总皂苷溶于b步骤的混合溶剂中；

d.b步骤混合溶剂分层，上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相和流动相先后泵入高速逆流色谱内，c步骤溶液经进样阀进入色谱柱；进样完毕后继续泵入流动相；

e.依据蒸发光散射检测器谱图分别收集四种甾体皂苷的流分，浓缩至干，即得四个大蒜甾体皂苷1、2、3和4。结构式如下：