[发明专利]一种高产γ-氨基丁酸的生产方法及应用

权利要求书

1.高产γ-氨基丁酸（GABA）的生长短乳杆菌S5，其保藏号为CGMCC NO.3414。

2.一种制备权利要求1所述CGMCC NO.3414的方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）菌株的筛选:从我国北方自然腌制的酸菜或汤中，采用双层平板法，即含有5％的碳酸钙和氨基丁酸，30℃培养48h，挑选具有透明圈的菌落进行发酵，采用高效液相色谱检测GABA含量，筛选出一株产量1.4g/L乳杆菌，编号为S1，转接在斜面上于4℃冰箱保藏；

（2）紫外线—吖啶橙诱变:取生长良好的短乳杆菌S1种子液,在紫外照射90s，然后把600μL经过紫外诱变的菌悬液接入到含有5mL诱变培养基的试管中30℃避光水浴振荡培养12h；

（3）N⁺离子注入诱变:取生长良好的短乳杆菌种子液,用浓度8%无菌甘油溶液稀释到100倍,取100μL均匀涂布于无菌平皿上,以无菌风吹干,取镜检无细胞重叠者进行离子注入，用N⁺离子进行注入,注入能量为30keV,注入剂量为0ions/cm² ～2.0×10¹⁴ions/cm²,靶室真空度为1.2×10^-3Pa，注入后取出平皿,以900μL浓度为0.85%生理盐水洗脱,采用种子培养基进行上,30℃培养3d，其诱变流程图如图2；      

（4）将种子培养基中的菌株培养液以10%(v/v)接种量转接于驯化培养基中，在30℃下，150r/min摇床培养12h，在转接于下一驯化培养基中，最后经过分离纯化培养，获得单菌落，然后进行摇瓶发酵实验选取高产菌株；其中的驯化培养基（Ⅰ） (g/L)：玉米糖化液10，蛋白胨10，酵母浸出粉15，微量元素液15mL 谷氨酸 60 ；驯化培养基（Ⅱ）(g/L)葡萄糖15，酵母粉20，蛋白胨10，谷氨酸 70 ；驯化培养基（Ⅲ）(g/L)在等电点废液中添加葡萄糖15，酵母粉20谷氨酸 60 驯化培养：

（5）诱变菌种初筛:将吖啶橙紫外诱变和N⁺注入后的菌种在无菌操作条件下，用无菌水稀释到10^-7～10^-9，取100μL涂布到初筛平板上，30℃培养1～3d，将能在含有CaCO₃和高浓度GABA生长且有透明圈的单菌落保存与斜面，以备复筛；

（6）诱变菌种复筛:将保藏的初筛菌种接于液体种子培养基中进行活化，150r/min摇床培养12h，以10%(v/v)接种量转接于另一瓶液体种子培养基中，150r/min摇床培养12h，以10%(v/v)接种量，转接于复筛发酵培养基中，30℃静置发酵3d，用纸层析定性分析菌种是否高产GABA，并用HPLC定量分析GABA产量，将高产菌株保存于斜面中，以备分纯；

（7）高产γ-氨基丁酸菌株的获得:利用初筛平板从诱变后的菌株中筛选得到一株产GABA菌株，记为S5菌株，诱变菌株的筛选平板和菌体形态见附图3，诱变菌株发酵液纸层析色谱图见附图4。

3.权利要求2所述的制备方法，其中步骤（2）中的诱变培养基为：含有1mg/mL吖啶橙，剂量分别为80μL，100μL，150μL，200μL，250μL。

4.权利要求2所述的制备方法，其中步骤（6）中的分纯指的是：将高产菌株进行液体培养，并取1mL培养液将其稀释成10^-7～10^-9后涂布于平板上，30℃培养1～2d，观察菌落形态和革兰氏染色形态，记录并拍照。