[发明专利]靶向释药的抗癌蛋白质或多肽聚合物前药及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种含酸敏感断裂键的聚乙二醇修饰的抗癌蛋白质或多肽及其修饰方法。

背景技术

中药及天然药物抗肿瘤活性成分多且复杂，以往主要聚焦于小分子抗癌化合物，由于蛋白质类生物大分子相对不稳定易降解，容易受温度、酸碱度等的影响而变性，同时从生物体中分离提取活性蛋白比较复杂费时，对中药及天然药物中提取的生物大分子的研究相对浅薄；随着生物技术及其相关研究技术的发展，活性蛋白质的研究已经引起了国内外的广泛关注。因此，从天然药物中寻找蛋白多肽类活性成分，尝试从生物大分子的角度揭示中药及天然药物作用的物质基础和机理，将是中药及天然药物研究的一个重要方向。

目前，大量研究结果表明，从中药及天然药物中提取纯化的蛋白质具有多种活性，特别是抗肿瘤活性作用明显，但由于蛋白质类药物自身的缺点，最终限制了临床应用。目前还没有一种抗肿瘤蛋白质上市或进入临床研究。

大分子蛋白质药物存在诸多缺点，主要表现为：1)由于本身为异原性蛋白质，体内给药易产生免疫原性从而不利于多次给药。2)由于体内血液系统的蛋白酶的降解作用以及免疫系统的吞噬等作用使得其体内半衰期很短，全身给药，药物本身难以达到肿瘤组织。3)天然抗肿瘤蛋白质类活性成分往往为非特异细胞毒性药物，全身给药不良反应多。

鉴于抗癌蛋白质类活性成分的缺陷，尽管体外显示一定的抗肿瘤作用，体内给药达到肿瘤组织浓度极低，若大剂量给药，必将产生较大的毒副反应。到目前为止，还没有一个活性成分上市或进入临床研究。

目前主要采用抗体与天然毒素如蓖麻毒素A链制成免疫毒素，甚至采用基因重组技术进行人源化，减少异源化蛋白质的免疫源性，开展免疫毒素(蓖麻毒素A链-抗体)的临床肿瘤治疗。

绝大多数肿瘤内部血管生长迅速不规则，组织血管大量再生，同时肿瘤细胞膜和肿瘤血管内皮细胞膜上一些蛋白质高度表达，构成肿瘤细胞和血管靶向识别的作用靶点，如整合素(αvβ3)、核仁素(nucleolin)、表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)等；血管结构有缺陷，内部淋巴系统消除慢，存在“增强渗透和滞留效应”(Enhanced Permeability and Retention，EPR)，使大分子和纳米颗粒易滞留到肿瘤内部。另外，肿瘤组织的pH明显比正常组织和血液低，达到6.5左右。大多数抗癌药物对肿瘤靶向性差，有严重不良反应(如骨髓抑制、脱发、腹泻、强烈恶心等)，患者顺应性差，甚至终止治疗。

目前蛋白质类药物载药转运体系有脂质体、纳米粒、聚乙二醇修饰等，由于蛋白质类药物不太稳定且水溶性强，脂质体、纳米粒作为载药转运体系载药率不高(一般不超过30％)，目前还没有全身给药的蛋白质类脂质体或纳米率上市；采用长链聚乙二醇共价修饰蛋白质，延长其体内半衰期同时减少其免疫原性，降低蛋白药物在转运过程中的降解是聚乙二醇修饰蛋白质的公知技术，目前有较多的聚乙二醇化蛋白质类药物上市，大大减少给药频率。

本人的研究结果也表明采用高分子量的聚乙二醇分别通过硫醚键和二巯键连接蓖麻毒蛋白A链，研究其免疫原性、体内外毒性、抗肿瘤活性和组织分布。结果表明，蓖麻毒蛋白A链经聚乙二醇修饰后毒性、免疫原性和抗癌活性均有明显下降，断链后其免疫原性、毒性和抗肿瘤活性基本可以恢复；体内研究结果显示，与蓖麻毒蛋白A链相比，偶联物的生物半衰期明显延长，肝脾等组织摄取率显著下降，随时间延长逐渐浓集于肿瘤组织，显示一定的肿瘤靶向作用。

由此可见，蛋白质类药物可以通过其表面聚乙二醇化，利用高分子量的聚乙二醇等聚合物长链分子的空间障碍作用和其强亲水性而在其表面形成水分子云的“遮蔽”作用，可以减少其进入体内后免疫原性，减少体内血液系统的蛋白酶的降解作用以及免疫系统的吞噬等作用使得其体内半衰期大大延长。但简单的共价修饰往往使修饰的蛋白质活性大大下降，而聚乙二醇通过可以断裂的连接键修饰的蛋白质类药物达到靶组织或细胞后，连接键断裂，释放活性药物，可发挥其抗癌效果，是目前蛋白质或纳米粒聚乙二醇化研究的方向。

抗癌蛋白质或多肽类，如蓖麻毒素A链等表面活性基团有伯氨基和巯基，其中由于赖氨酸引入的伯氨基较多，聚乙二醇修饰蓖麻毒素A链伯氨基，可能由于修饰的位点较多且多为随机修饰，修饰后易造成蛋白质活性的损失和最终产品的不均一。而蓖麻毒素A链表面巯基较少，试验表明，利用蓖麻毒素A链表面的巯基进行聚乙二醇化修饰，基本是1∶1修饰，故利用巯基作为活性基团进行聚乙二醇化修饰，可以是修饰的终产物的形态和活性均一。