[发明专利]一种通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法

权利要求书

1.一种通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)构建CgHSP70基因的植物表达载体：

以菊花‘钟山紫桂’为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，在CgHSP70基因的上下游分别引入SmaI和XbaI酶切位点，上游引物为：CgHSP70-F：5′-CCCCGGGATGGCTGGTAAAGGTGAA-3′，下游引物为CgHSP70-R：5′-AGTAGAACAGATAAATATCGACCACA-3′，将扩增出来的含有CgHSP70完整开放阅读框的PCR产物片段与T-载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，提取阳性质粒，由SmaI和XbaI双酶切得到的CgHSP70基因片段，与SmaI和XbaI双酶切线性化的表达载体pCAMBIA1301连接，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA1301-CgHSP70构建成功，所述的CgHSP70基因序列为SEQ IDNO.1；

(2)采用农杆菌介导法将CgHSP70基因的植物表达载体转入到切花菊中，进行培养初步获得抗性植株。

2.根据权利要求1所述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于步骤(2)的操作过程为：制备感受态的农杆菌，将步骤(1)中构建的含有CgHSP70基因的植物表达载体pCAMBIA1301-CgHSP70转入感受态的农杆菌菌株中；取组培瓶中菊花苗顶端叶盘作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的转入了CgHSP70基因植物表达载体的农杆菌菌液中感染10min，用滤纸吸干菌液后再将其接种到共培养基上黑暗中共培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养3～4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。

3.根据权利要求2所述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8～6.0，100Kpa、121℃灭菌20分钟；预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；筛选培养基：MS+潮霉素10mg/L+羧卞青霉素500mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L；生根培养基：1/2MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸0.1mg/L。

4.根据权利要求1或2所述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于所用的农杆菌菌株为EHA105。

5.根据权利要求1或2所述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于将转CgHSP70基因初步获得的抗性植株进行PCR和荧光定量PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系：

(1)PCR检测

取生根筛选得到的潮霉素抗植株嫩叶及未转化植株嫩叶，采取CTAB法提取基因组DNA，将hptII基因作为检测目标，根据hptII基因两端合成扩增反应引物，扩增片段长为408bp，引物序列为：HII-F：CTCGATGAGCTGATGCTTTGGG，HII-R：GCTTCTGCGGGCGATTTGTGTA；分别以潮霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以HII-F和HII-R为引物，进行PCR检测；分子检测筛选获得抗性株系，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；

(2)荧光定量PCR检测

建立扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的C_T值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物片段长为115bp，引物序列为：HSP-F：GCTTGCTGAGGCGGATGAGT和HSP-R：ACCTGATGGTGCGGGTTCCTC，以PsaA扩增的基因片段为内标，扩增片段长度为127bp，引物序列为：PsaA-F：CCAATAACCACGACCGCTAA，PsaA-R：CACAGTCCTCCCAAGTAA，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。

6.根据权利要求5所述的通过转CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于对所获得转基因植株后代进行抗性分析：

(1)采集转基因株系和未转化植株生长一致的幼苗叶片，用去离子水洗净，纱布擦干，去除主脉并剪成0.5cm²的小片，放入烧杯中并准确加入20mL去离子水，用真空泵抽气10min后分别在室温、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的水浴中放置20min，取出静置冷却2h，并测定相对电导率，拟合Logistic回归方程，得到高温半致死温度(LT₅₀)；

(2)转基因株系及野生型植株高温胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的高温胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株WT进行45℃高温胁迫处理，处理后，将转基因及未转基因植株苗种植于营养钵中恢复生长一周，然后统计存活率并观察生长情况；

(3)转基因株系及野生型植株干旱胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的干旱胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株WT进行干旱胁迫处理，处理后，将转基因及未转基因植株苗种植于营养钵中恢复生长两周，然后统计存活率并观察生长情况；

(4)转基因株系及野生型植株盐胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的盐胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株WT进行盐胁迫处理，处理后将植株根系用去离子水冲洗3遍，并种植于新营养钵中浇足水恢复生长一周，统计植株存活率并观察生长情况。