[发明专利]产氢量提高的基因工程衣藻及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中产氢量提高的基因工程衣藻及其应用。

背景技术

化石能源不可再生，且大量使用会造成环境污染和气候变化。因此，迫切需要开发可再生清洁新能源。氢能清洁可再生，燃烧只产生水和巨大能量，不产生任何污染物，是最理想的清洁能源。

微藻光合产氢是蓝藻和绿藻利用太阳能分解水产氢的过程，具有可再生、制氢过程清洁等明显优点，是直接利用太阳能生物转化制氢的有效途径。由于光合作用水光解放氧和产氢是微藻细胞内两个既相互矛盾又密切关联的复杂生物代谢过程，而目前人们对这些过程发生机制和调节方式还不清楚，致使遗传改造不能有效进行，光能转化制氢的效率得不到显著提高，从源头上严重制约了微藻光合制氢途径的应用。因此高效产氢遗传藻株的构建是推进该途径工业化应用的关键。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种基因工程衣藻。

本发明所提供的基因工程衣藻，是通过抑制出发衣藻中铁氧化还原蛋白-NADP还原酶编码基因的表达水平，得到的基因工程衣藻。

所述抑制所述铁氧化还原蛋白-NADP还原酶编码基因的表达水平是通过RNA干扰实现的。

所述RNA干扰是通过将双链RNA的编码DNA导入衣藻细胞中实现的；其中，所述双链RNA的一条链的核苷酸序列是将序列表中序列1的碱基序列中的T替换为U得到的核糖核苷酸序列，另一条链与其反向互补。

所述双链RNA的编码DNA是如下双链DNA片段：SEQ_正向-X-SEQ_反向；

其中，SEQ_正向的核苷酸序列是序列表中序列1的碱基序列；

SEQ_反向与所述SEQ_正向反向互补；

X是SEQ_正向与SEQ_反向之间的间隔序列，X与所述SEQ_正向和SEQ_反向均不互补。

所述双链RNA的编码DNA是通过重组表达载体导入所述出发衣藻的；

所述重组表达载体为将所述双链RNA的编码DNA插入表达载体Maa7/XIR的多克隆位点得到的重组表达载体；

所述出发衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻株CC-400。

本发明的另一个目的是提供所述基因工程衣藻在制备氢气中的应用。

本发明的又一个目的是提供一种双链RNA。

本发明所提供的双链RNA，为如下所示：

一条链的核苷酸序列是将序列表中序列1的碱基序列中的T替换为U得到的核糖核苷酸序列，另一条链与其反向互补。

本发明的又一个目的是提供所述双链RNA的编码DNA。

所述双链RNA的编码DNA，为如下双链DNA片段：

SEQ_正向-X-SEQ_反向；

其中，SEQ_正向的核苷酸序列是序列表中序列1的碱基序列；

SEQ_反向与所述SEQ_正向反向互补；

X是SEQ_正向与SEQ_反向之间的间隔序列，X与所述SEQ_正向和SEQ_反向均不互补。

含有所述编码DNA的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体为将所述编码DNA插入表达载体Maa7/XIR的多克隆位点得到的重组表达载体。

本发明以光合产氢模式绿藻莱茵衣藻为材料，采用RNA干扰技术(RNAi，RNAinterference)下调光合关键基因FNR1的表达，通过抗性标签筛选获得突变体株系，并用RT-PCR方法在转录水平验证RNAi藻株中FNR1基因下调，经气相色谱测定缺硫处理48小时时RNAi藻株的产氢量较野生型藻株提高6-10倍。这一突变藻株的获得为微藻光合制氢产业化的实现奠定了基础。

附图说明

图1为FNR1 RNAi载体构建示意图。其中，Pro：启动子；Sp：间隔区；ter：终止子；aphVIII：巴龙霉素抗性标签序列；S、Xh、E、Xb、B代表不同的限制性内切酶酶切位点，分别为：SacI、XhoI、EcoRI、XbaI、BamHI；Maa7 3’UTR：5-FI抗性标签序列。

图2为野生型衣藻(CC-400)和RNAi克隆(F1和F3)在含有5-FI(5mM)固体培养基上的生长情况。