[发明专利]一种靶向作用于蛋白激酶非活性构象的化合物筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质结构预测和药物分子虚拟筛选技术领域，具体涉及蛋白激酶的非活性构象的预测与筛选方法，蛋白激酶II型抑制剂对接构象的预测与虚拟筛选方法。

背景技术

随着人类基因组测序的完成，人们发现基因组中约有518种不同的基因编码了各类激酶，占了总基因数的2%左右。这个庞大的蛋白激酶家族调节着细胞内几乎方方面面的活动，包括信号的转导、DNA的转录以及细胞代谢、细胞周期的运行，进而控制着细胞的分化和凋亡。所以激酶的活化与失活关系重大，一旦产生异常便会导致各种疾病的发生，包括癌症、中枢神经系统紊乱、心血管疾病以及自体免疫失调等。正因为如此，长期以来蛋白激酶都被认为是最重要的药物靶点之一。

尽管激酶家族的成员众多，但是X射线衍射得到的晶体结构表明所有蛋白激酶的催化结构域都十分的相似——一般由一个较小的N-lobe和一个较大的C-lobe组成，在2个lobe之间存在一道裂缝，ATP结合位点以及对于磷酸基团转移重要的活性链段（activation loop）都位于那里。几乎所有蛋白激酶在ATP结合位点附近都有一段3个氨基酸残基的序列――Asp-Phe-Gly（DFG），而DFG又同时处于活性链段的N端。这段基序的构象状态已经被证明对于激酶的活性具有决定性的作用。在活性状态下，Phe位于ATP结合位点附近的疏水腔中，而Asp位于腔外活性链段的另一侧（DFG-in构象）；然而在一个被称为DFG-flip的变化发生后，激酶就会处于非活性状态。在这个状态下，这2个残基的位置恰恰相反：Asp位于疏水腔侧，而Phe被旋转到外侧（DFG-out构象）。

由于处于DFG-out构象的蛋白激酶是非活性的，这启发了人们去寻找结合这种结构的药物小分子来抑制激酶。这种小分子被称为二型（II型）抑制剂，它们能够诱导蛋白激酶形成非活性的DFG-out构象并占据由此产生的疏水腔。研究证明它们较之靶向激酶活性结构的type-I抑制剂具有更好的特异性和有效性。抗癌药物伊马替尼（imatinib）就是其中的一个例子。它能够特异性地结合BCR-ABL、c-Abl、 c-Kit和PDGFR等激酶，从而治疗慢性骨髓白血病和其他癌症。

基于受体结构的药物设计是现今新药开发中的一个重要手段。但是至今只有小部分的DFG-out晶体结构被人们得到，所以在结构数据上存在的空缺大大延缓了发现新II型抑制剂的进度。在2008年Protein Data Bank的哺乳动物激酶数据中，70%以上的结构都是DFG-in构象的，22%处于过渡构象，还有约3%的结构是II型抑制剂不相容的DFG-out结构。因此，目前已知的激酶结构数据绝大部分都无法用于基于受体结构的II型抑制剂的开发研究。为了解决这个问题，发展出一种能从已有的大量激酶DFG-in构象得到相应的DFG-out构象的计算模拟方法至关重要。

目前提出一个可能的DFG-flip的机制分为3个步骤：活性构象：DFG-in/αC-in ?过渡构象：DFG-in/αC-out? 非活性构象：DFG-out/αC-in。

在最近以c-Abl为对象的研究中发现，DFG中Asp的质子化对产生DFG-out构象起着关键的作用，Shan et al. 用分子动力学（MD）的方法成功模拟出了从DFG-in到DFG-out构象的变化 （Shan et al., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2007,  Vol106: 139-144），发现对于Asp和Phe来说最重要的是它们所处的环境的改变。在DFG-in构象中，Asp处于一个极性、充满电荷的水性坏境中，而Phe处于一个疏水的环境中。在发生DFG-flip之后，情况正好相反，Phe处于极性的环境而Asp处在一个几乎疏水的环境。电荷在疏水的环境中要以极大的自由能为代价，所以Asp的质子化是十分重要的。同时，在DFG-in的构象中Asp骨架的扭转角是一个高能状态，而Phe此时就处在疏水环境来使能量达到平衡。Shan et al.和过去的研究都暗示着DFG-in可能并不是一个能量最低的构象而是一个在功能上最优化的结构。DFG-flip可能是用来在磷酸化后促进ADP的释放，而这在激酶催化反应中是一个重要的限速步骤。因此蛋白激酶的DFG-in和DFG-out构象的能量很可能是相近的，它们都是最低的能量构象并在实际溶液中处于动态平衡。