[发明专利]一种靶向作用于蛋白激酶非活性构象的化合物筛选方法

权利要求书

1.一种预测蛋白激酶非活性构象的计算模拟方法，其特征在于具体步骤为：

第一步，构建初始结构模型

从PDB数据库中下载既有DFG-in又有DFG-out构象的蛋白激酶PDB文件；对所得的PDB文件进行预处理，去除其中的水分子或其他分子；如果是多聚体则取其中的一个单体，如果晶体结构中含有磷酸基团，用MODELLER同源模建程序将其突变为原始残基，对于缺少残基的蛋白激酶也同样采用MODELLER程序以自身为模板进行补齐；然后将所得的PDB文件用Rosetta软件的relax功能进行优化得到初步的起始结构模型；

第二步，蛋白激酶的活性链段重塑

采用Rosetta 3软件的的“loop_relax”功能来进行蛋白激酶的活性链段重塑，按Rosetta 3的loopmodeling功能，设定目标蛋白质的若干片断为对象，对其进行重新的结构预测，运用模拟退火等算法寻找目标片断的最低能量构象；其中，

首先从蛋白激酶的FASTA序列得到其fragments文件，然后设定需要重塑的链段在蛋白质中的位置，其中设定的链段对象具体是以DFG基序之前第二个残基为起始，蛋白激酶活性链段的C末端为结尾的；以这段序列中位于中点附近最亲水的残基为剪切断点；最后设定文件所在的路径以及默认的参数，然后递交计算机进行计算；在活性链段重塑之后，对结果的侧链进行全原子优化，获得最终的全原子最低能量构象；

第三步，将预测构象按几何分类方法，进行DFG-in和DFG-out分类

对于重塑后获得的模型，按DFG-in、DFG-out和过渡构象进行分类；如果模型的Asp和Phe残基和相应的DFG-in结构中的这2个残基都位于同侧，那么就把它归为DFG-in构象的；如果情况正好相反，那么就把它归为DFG-out构象的；其它所有的模型都归为过渡构象；

第四步，DFG-out模型的选择

使用PASS程序来探测活性位点附近可能的结合位点，以进一步分析已知DFG-out结构中活性位点的疏水腔，PASS的结果显示在DFG-out结构的活性位点存在有3个结合口袋，这三个结合口袋中心被分别记为B₁、B₂和B₃，这三个口袋被Seeliger et al. 分别定义为疏水区I、腺嘌呤口袋以及异构位点；

使用LIGSITE程序来计算口袋中相距1 ?的格点数，将格点数转化为1 g?ml^-1密度的水分子个数，即将活性口袋中的格点放入一个足够大的水盒子中，并且认为任何离格点最近距离大于1.6 ?的水分子是未被占据的；按活性腔中能包含大于20个水分子为标准来选择DFG-out模型，构成可用于分子对接的非活性构象系综。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第一步中，优化后的模型与DFG-out晶体结构叠加后，两者在N-lobe之间存在结构上的不同；这个构象变化是N-lobe绕一个轴旋转所致；这个轴被定义为垂直于一个包含催化域坐标中心和αC螺旋的首尾残基在内的平面，并且穿过连接N-lobe和C-lobe的铰链区中点残基的一条直线；然后DFG-out构象的N-lobe相对于相应的DFG-in构象向外旋转5-15度；其旋转方式按如下方式进行：

使用4个保守残基两两之间的4对距离之和；这4个保守残基是形成盐桥的Lys273和Glu288以及DFG中的Asp、Phe；这4对距离是Lys273到Asp和Phe的距离以及Glu288到Asp和Phe的距离；如果这4个距离之和，大于32 ?的，其N-lobe不需要旋转；介于30-32 ?的，将其N-lobe外旋5度；小于30 ?的，将其N-lobe外旋15度。