[发明专利]猪链球菌噬菌体裂解酶的乳酸乳球菌表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，具体是一种猪链球菌噬菌体裂解酶的乳酸乳球菌表达方法。

背景技术

猪链球菌病是一种人兽共患传染病，能导致仔猪患脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎和人的脑膜炎。猪链球菌2型流行最广，对猪的致病力也最强，给养猪业造成巨大的经济损失，在公共卫生方面，对相关从业人员的生命安全构成严重威胁。对于猪链球菌病的治疗主要是抗生素治疗，然而，随着抗菌药物的广泛应用，细菌耐药菌株的传播进一步加剧。而裂解酶是由噬菌体基因组编码，能够水解细菌细胞壁的酶。噬菌体裂解酶像噬菌体一样仅攻击细菌，而不影响动物细胞，并具有较高的特异性，因此该酶不影响无害或有益的动物寄生菌。一般认为，裂解酶作用于细菌的速度极快，以至于细菌不会对该酶产生抗性。噬菌体的裂解酶有比噬菌体更为广泛的抗菌谱。所以，裂解酶作为新型抗菌药物具有一定的优势。应用大肠杆菌表达系统虽可大量表达裂解酶，但表达产物需进一步提纯后方能应用于动物。本发明应用食品安全级的乳酸乳球菌表达猪链球菌烈性噬菌体SMP的裂解基因，获得了有活性的裂解酶，在体外可对多株临床分离的猪链球菌有裂解作用，为直接进行临床应用提供了可能。

经过对现有技术的检索发现，王丽平等发表了“32种抗菌药物对临床分离猪源链球菌的体外抗菌活性”，该文献记载了一些猪场分离的猪链球菌对32种抗菌药物的耐药性的研究结果显示，临床分离菌株以耐药菌为主，且大都呈多重耐药，尤其对磺胺类药物、林可胺类、四环素类、大环内酯类、氨基甙类药物的耐药性最为严重，耐药不仅普遍，且多为高度耐药，寻找另一种抗菌机制或抗菌药物显得尤为重要。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种猪链球菌噬菌体裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，利用PCR扩增猪链球菌烈性噬菌体SMP的裂解酶基因，获得目的片断，再将目的片断与pNZ8148载体连接，得到重组表达质粒，导入乳酸乳球菌L9000表达，获得一个分子量为52kDa的融合蛋白，得到有活性的裂解酶，获得的裂解酶，在体外可对多株临床分离的猪链球菌有裂解作用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种猪链球菌噬菌体SMP裂解酶，其DNA序列如Seq ID No.3所示。

本发明涉及上述猪链球菌噬菌体SMP裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，包括如下步骤：

步骤一，从猪链球菌2型烈性噬菌体宿主菌SS2-H中纯化得到猪链球菌2型烈性噬菌体；

所述的纯化是指：以SS 2-H为指示菌，采用双层琼脂法培养噬菌体。

所述的双层琼脂是指：底层平板为1.5wt％琼脂，顶层为0.7wt％琼脂糖。

所述的双层琼脂法是指：将噬菌体SMP用链球菌THB培养基(Todd-Hewitt broth，THB培养基)作10^-2、10^-4、10^-6等梯度稀释，取200μL上述噬菌体稀释液与200μL宿主菌SS2-H混匀，再加入1mol/L CaCl₂至终浓度0.1mol/L，将上述混合物放置于37℃孵育15min后与50℃已熔化的顶层琼脂混匀，浇注在底层平板上，室温放置至上层琼脂凝固后，倒置于37℃培养箱培养10-12h，取长成密集相连噬斑的平板，每板加入5mL SM液(配方：NaCl 5.8g，MgSO4·7H2O 2g，1M Tris·CL(pH7.5)50ml，2％明胶5ml，加去离子水至1000ml)，在4℃摇床晃动3小时，收集含噬菌体的SM液，置于无菌离心管中，4000g离心10分钟去除细胞碎片，得到纯化的噬菌体。

步骤二，以步骤一所得噬菌体为材料提取其基因组DNA，并以此DNA为模板，应用PCR扩增得到裂解酶基因，如Seq ID No.3所示；

所述的提取是指：在噬菌体重悬液中加入20mg/mL蛋白酶K至终浓度50μg/mL，37℃温育30分钟，再加10％SDS(十二烷基磺酸钠)至终浓度为0.5％，混匀后将消化混合物于56℃温育1小时，冷却至室温。用等体积酚/氯仿抽提，3000g离心5分钟将两相分开，将亲水相收集至另一个离心管中。在回收的亲水相中加入3mol/L乙酸钠至终浓度0.3mol/L，混匀后加两倍体积的无水乙醇轻轻洗涤，13000g离心2分钟，弃上清，回收DNA沉淀。用适当体积的TE(核酸溶解缓冲液)溶解噬菌体DNA。

所述的PCR扩增，具体包括以下步骤：