[发明专利]猪链球菌噬菌体裂解酶的乳酸乳球菌表达方法

权利要求书

1.一种猪链球菌噬菌体SMP裂解酶，其DNA序列如Seq ID No.3所示。

2.一种根据权利要求1所述的猪链球菌噬菌体SMP裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，从猪链球菌2型烈性噬菌体宿主菌SS2-H中纯化得到猪链球菌2型烈性噬菌体；

步骤二，以步骤一所得噬菌体为材料提取其基因组DNA，并以此DNA为模板，应用PCR扩增得到裂解酶基因，如Seq ID No.3所示；

步骤三，应用乳酸乳球菌表达步骤二扩增所得裂解酶基因，得到融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的猪链球菌噬菌体SMP裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，其特征是，所述的纯化是指：以SS₂-H为指示菌，采用双层琼脂法培养噬菌体。

4.根据权利要求3所述的猪链球菌噬菌体SMP裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，其特征是，所述的双层琼脂是指：底层平板为1.5wt％琼脂，顶层为0.7wt％琼脂糖。

5.根据权利要求3所述的猪链球菌噬菌体SMP裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，其特征是，所述的双层琼脂法是指：将噬菌体用链球菌培养基作10^-2、10^-4、10^-6等梯度稀释，取200μL上述噬菌体稀释液与200μL宿主菌SS2-H混匀，再加入1mol/L CaCl₂至终浓度0.1mol/L，将上述混合物放置于37℃孵育15min后与50℃已熔化的顶层琼脂混匀，浇注在底层平板上，室温放置至上层琼脂凝固后，倒置于37℃培养箱培养10-12h，取长成密集相连噬斑的平板，每板加入5mL SM液，在4℃摇床晃动3小时，收集SM液放无菌离心管，4000g离心10分钟去除细胞碎片，得到纯化的噬菌体。

6.根据权利要求2所述的猪链球菌噬菌体SMP裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，其特征是，所述的提取是指：在噬菌体重悬液中加入20mg/mL蛋白酶K至终浓度50μg/mL，37℃温育30分钟，再加10％SDS至终浓度为0.5％，混匀后将消化混合物于56℃温育1小时，冷却至室温，用等体积酚/氯仿抽提，3000g离心5分钟将两相分开，将亲水相收集至另一个离心管中，在回收的亲水相中加入3mol/L乙酸钠至终浓度0.3mol/L，混匀后加两倍体积的无水乙醇轻轻洗涤，13000g离心2分钟，弃上清，回收DNA沉淀，用适当体积的核酸溶解缓冲液溶解噬菌体DNA。

7.根据权利要求2所述的猪链球菌噬菌体SMP裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，其特征是，所述的PCR扩增，具体包括以下步骤：

2.1)根据Genbank的EF116926号SMP DNA序列，设计两条引物P1及P2，分别在5’端和3’端插入限制性内切酶XbalI和Hind III的酶切位点，其中：引物P1如Seq ID No.1所示，引物P2如SeqIDNo.2所示；

2.2)用引物P1、P2按以下进行PCR扩增：PCR体系为2×PCR mix 25μL、10μM/L的P11μL、10μM/L的P21μL、噬菌体的SM溶液5μL、水18μL；PCR参数为35循环，每个循环为95℃预变性5min后；95℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min 45s；72℃延伸10min；

2.3)反应结束后，取5μL产物用于1％的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物用PCR产物回收试剂盒回收。

8.根据权利要求2所述的猪链球菌噬菌体SMP裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，其特征是，所述的表达，包括以下步骤：

3.1)目的基因片段与pMD18-T载体的连接；

3.2)pMD18-T基因重组质粒的鉴定；

3.3)目的基因片段与pNZ8148载体的连接；

3.4)乳酸乳球菌感受态细胞的制备；

3.5)电转化入乳酸乳球菌；

3.6)LySMP蛋白的诱导表达。

9.根据权利要求2所述的猪链球菌噬菌体SMP裂解酶的乳酸乳球菌表达方法，其特征是，所述的表达，具体步骤为：

i)将目的基因片段与pMD18-T载体采用以下连接反应体系进行连接：

混匀后16℃反应30min，连接产物将用于转化DH5α感受态细胞，取2μL连接产物加入DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃循环水浴作用90s，冰浴2min，再加入800μL LB培养基37℃120转/分振荡培养45min，取100μL振荡培养物涂布含50μg/mL卡那霉素的KanLB平板，倒置平板37℃培养12-16h；

ii)将平板上生长的单菌落挑取数个接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养12h，用质粒提取试剂盒提取质粒，提取的质粒分别用XbalI、HindIII双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳，如果出现两条条带的质粒即为pMD18-T基因重组质粒，切胶回收1500bp的目的基因片段，双酶切反应体系如下：

iii)用质粒提取试剂盒提取pNZ8148质粒，采用分别用Xbal I、Hind III双酶切，双酶切反应体系如下：

混合物置于37℃温箱作用2h，酶切产物用EB染色，进行电泳后，用凝胶回收试剂盒回收；

iv)连接带有粘性末端的目的基因片段和乳酸乳球菌表达载体，16℃过夜，连接产物直接用于转化，连接反应体系如下：

v)挑取新鲜培养的单菌落，接种于5mL GM17液体培养基，30℃过夜培养后加入150mLGM17培养基中，30℃培养至OD₆₀₀0.5，转移培养液到预冷的500mL离心管中，冰上放置10min，4℃，5000r/m离心10min，用15mL预冷的电转化缓冲液悬浮，重复3次，4℃，5000r/m离心10min，用1.5mL冰冷的电转化缓冲液悬浮，分装每管40μL，-80℃冻存；

vi)取制备的乳酸乳球菌电转化感受态细胞，冰上放置5min，每管感受态细胞中加入连接产物20μL，轻柔混合后冰浴1min，将感受态细胞和连接产物的混合物转入2mm的预冷电转化杯中进行25μF，12.5KV/cm，200Ω的电击，恢复培养基用SGM17MC，在含氯霉素的GM17固体培养基平板上，30℃保温24～72h，挑取转化子，接种于含氯霉素的GM17液体培养基，30℃培养过夜，pcr反应，1％琼脂糖凝胶电泳，阳性重组质粒命名为pNZ8148-lys，同时，电转pNZ8148入乳酸乳球菌电转化感受态细胞；

vi)选择过夜培养的克隆阳性菌0.8mL接种于10mL含有5μg/mLCm的M17培养基中，30℃120转/分振荡培养至OD6000.4，加入nisin至终浓度为1ng/mL，30℃振荡培养3h。