[发明专利]一种提高轮叶党参抗癌活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高轮叶党参中抗癌活性成分的方法，具体地说，本发明涉及一种利用酵母菌发酵技术，提高轮叶党参中抗癌活性成分含量的方法。

背景技术

轮叶党参（Codonopsis Lanceolata Benth.et Hook.F.）又名羊乳、四叶参、山胡萝卜、山海螺及白蟒肉等，是桔梗科党参属植物羊乳的根，多分布于中国东北、华南、西南地区及朝鲜、日本、俄罗斯等国家，在民间常将它作为山野菜食用。传统上其根入药，味甘、性平，是常用的补中益气药，有排脓消肿、清热解毒、补虚通乳、养阴润肺及祛痰之功效。主要用于病后体虚、乳少、肺阴虚、肿痈、乳痈、疮疡肿毒等症。现代药理研究表明轮叶党参具有镇静镇痛、提高学习记忆、抗氧化和增强免役等作用。文献报道轮叶党参中含有多糖、齐墩果酸、皂苷类、黄酮类、挥发油类等成分。而有研究表明多糖，齐墩果酸有较好的预防肿瘤的作用。然而，用一定浓度的乙醇水溶液浸泡轮叶党参生药材24小时后，得到的提取物对小鼠肿瘤生长没有明显的抑制作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高轮叶党参抗癌活性的方法，具体是提供一种生物发酵方法，以显著提高轮叶党参抗癌有效成分含量。

本发明的技术方案为：

一种提高轮叶党参抗癌活性的方法，首先

将鲜轮叶党参切片或匀浆，

或者将干轮叶党参粉碎，

或者将干燥的轮叶党参粉末，

然后用水浸泡，高压灭菌，在温度降至30℃以下时在无菌条件下加入活性酵母0.5 %~5.0 %，葡萄糖1%~8%，在20~37℃条件下发酵1~10天，发酵结束后，加入极性溶剂，在0℃~100℃优选70℃~100℃下提取5分钟~24小时，过滤，回收溶剂，减压浓缩或冷冻干燥。

所述的极性溶剂为乙醇或水。

所述经减压浓缩或冷冻干燥后所得到的轮叶党参提取物，用液液分配技术和色谱技术进行精制，得到轮叶党参皂苷，用于制备抗癌药物或食品，也可在肿瘤化学预防制剂中的应用。

将发酵的轮叶党参分别用蒸馏水、30%乙醇、50%乙醇及70%乙醇加热回流提取5分钟~24小时，过滤或离心，除去不溶性物质后，减压浓缩，用65%~80%乙醇醇沉，去掉蛋白质和多糖，回收乙醇，真空干燥或冷冻干燥，得到轮叶党参提取物，通过柱层析方法进行精制，得到轮叶党参皂苷，用于肝癌抑制实验和二乙基亚硝胺（DEN）诱发肝癌的预防实验。

本发明人用轮叶党参乙醇提取物进行动物酒精性肝损伤保护作用研究，证明其具有明显抑制乙醇对肝脏的损伤作用，还证明了轮叶党参总皂苷具有明显的抗突变作用。本发明人对轮叶党参乙醇提取物的抗突变成分进行过系统分离鉴定，发现其中的齐墩果酸、蒲公英赛醇、α- 菠甾醇等成分具有较强的抗突变作用，其中齐墩果酸的抗突变作用最强。

本发明人发现，轮叶党参用活性酵母发酵后得到的乙醇水溶液提取物，抑制小鼠体内H22肝癌生长作用明显优于未发酵的轮叶党参乙醇水溶液，其抑制率达到51%；明显抑制致癌物二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌癌前病变及肝毒性。用体外细胞培养方法证明发酵轮叶党参抗癌有效成分主要为轮叶党参皂苷。因此，采用适宜生物发酵技术，提高轮叶党参中的抗癌活性成分有利于将轮叶党参利用于肿瘤的预防和治疗。研究发现，在干燥的轮叶党参中加入一定浓度的活性酵母、葡萄糖，在适宜的温度下进行发酵，然后用乙醇水溶液提取，所得到的提取物，明显抑制小鼠体内H22肿瘤的生长。经有机溶剂萃取后，在体外明显抑制H22和HepG2癌细胞的增殖，且正丁醇萃取部位的活性最强。用活性酵母发酵轮叶党参之后，皂苷含量明显增高。本发明得到的发酵轮叶党参乙醇提取物还可以显著预防二乙基亚硝胺的肝脏毒性，可以预防肝癌的癌前病变。有效成分以轮叶党参苷、丁香苷为代表。 

本发明得到的提取物发酵轮叶党参总皂苷对小鼠H₂₂肿瘤的抑制作用及对DEN肝脏毒性的预防作用实验如下：

1材料与方法

1.1  试验药物 

轮叶党参为本地区野生轮叶党参，洗净，切片，晒干。

二乙基亚硝胺(DEN)为日本半井化学药品株式会社产品，注射用环磷酰胺为江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号01102521。MDA、GSTs、TNF-α试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。SUNRISE酶标仪为瑞士Tecan公司产品。