[发明专利]一种胸腺肽β4的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明生物工程技术领域，尤其涉及一种胸腺肽β₄的分离纯化方法。

背景技术

胸腺肽是胸腺分泌的具有生物活性的多肽的混和物，是一种免疫增强剂。在机体的免疫系统、神经内分泌系统、生殖系统中起到重要的调节作用。它能够改善机体的免疫状态，协调内分泌，提高机体对细菌病毒感染的抵抗力。胸腺肽已经用于多种疾病的辅助治疗，疗效显著，在饲料中添加亦能起到促生长作用。胸腺肽含有的多种多肽均具有一定的药效，其中一些已经用于疾病的治疗。如日达仙是Sci Clone公司生产的胸腺肽α₁，临床用于慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎以及恶性肿瘤等的治疗。

胸腺肽β₄是从胸腺素5和5A中分离得到的，是胸腺肽β家族中的一员。尽管胸腺肽β₄是从胸腺中分离得到的，但在机体众多组织中均有它的踪迹，在参与调节细胞及生理活动等一系列过程中呈现出功能的多样性，因此自它诞生时起，就引起了生物医学工作者的广泛关注。

胸腺肽β₄是由43个氨基酸残基组成的多肽，分子量4963，等电点为pH 5.1，在哺乳动物中高度保守。与胸腺肽α原或类胸腺肽不同，胸腺肽β₄是胞浆蛋白而非核蛋白。并且它只含有较少的疏水性氨基酸，不含有Lys-Lys-Xaa-Lys结构区域。

化学构象研究表明，胸腺肽β₄是以单链形式存在及发挥作用的，其第31～43残基和第18～30残基间是一内部重复区域，有6个氨基酸相同。虽然存在第4～12残基和第32～40残基两个α螺旋区，但是胸腺肽β₄没有β转角形成。

研究表明，胸腺肽β₄可以促进创伤的愈合，特别是对于眼角膜受伤有良好的疗效。用胸腺肽β₄治疗创伤是目前国内外研究的热点。研究表明，与生长因子的作用机理不同，胸腺肽β₄不能促进细胞的生长。胸腺肽β₄通过促进血管生长和细胞的迁移对创伤的愈合起作用，不仅对正常细胞起作用，且对年老的细胞起作用，因此在创伤愈合方面具有独特的优势。同时，研究表明胸腺肽β₄还可以促进头发的再生，其作用机理与促进创伤的愈合相似。

T淋巴细胞在抗肿瘤过程中起到关键性作用。在肿瘤的发生、扩散和转移过程中，免疫功能特别是细胞免疫功能降低是其重要因素。在机体肿瘤状态下，T细胞功能不全和抑制表现为其数量减少和功能改变以及T细胞亚群比例失调。胸腺肽对于胸腺依赖性T淋巴细胞的成熟和分化起着关键性作用，故可增强肿瘤化疗患者细胞免疫能力，起到辅助治疗的作用。最新的研究表明胸腺肽β₄基因的表达水平与癌细胞转移呈正相关，与肿瘤凋亡关系密切。因此，可通过对胸腺肽β₄表达水平的监测定位癌细胞，也可进一步研究通过改变胸腺肽β₄的表达能否抑制肿瘤的生长。

目前，对于胸腺肽β₄(Thymosin β₄，Tβ₄)分离纯化的报道多见于国外文献，国内对于此方面的研究较少，更多是集中于Tβ₄生理功能和医疗功效方面的研究。对于Tβ₄分离纯化的研究，国外所用方法包括了近年来广泛用于生化分离的超滤、层析、等点聚焦、高效液相色谱等技术。如：A.Roboti、E.Livaniou等采用色谱聚焦的方法，一次分离得到120mg Tβ₄；Ewald Hannappel，Friederike Wartenberg等采用等电聚焦和制备高效液相的方法，分离得到了Tβ₄和Tβ₉；Mahnaz Badamchian等采用制备高效液相进行Tβ₄的分离纯化；Allan L.Goldstein等分别采用阴离子或阳离子交换柱进行梯度洗脱，分离纯化得到Tβ₃和Tβ₄并确定了两者的结构。

上述所用方法，多数采用等电聚焦或高效液相方法，虽然上述方法获得产品纯度较高，但成本高、制备量小，同时对设备要求很高，不适合工业化生产。采用一步离子交换法虽然方法简单，成本低，但产品的纯度达不到医药应用的要求。

发明内容

本发明提供了一种阴阳离子色谱串联分离纯化胸腺肽β₄的方法，解决了传统方法设备要求高、不适合工业化生产的问题。